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硫酸二甲酯（DMS）足迹实验： DMS能使裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶会对甲基化的G残基作特异的化学切割。 而与蛋白结合的DNA片断上的G残基，不会被DMS甲基化，从而避开了六氢吡啶的切割作用。于是在DNA片断的序列中，不存在具这些G残基末端的DNA片断，出现了空白区。 甲基化干扰实验（methyltion interference assay） 根据DMS（硫酸二甲酯）能够使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理，设计出了另一种研究DNA与蛋白质相互作用的实验方法，即甲基化干扰实验。这种技术可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对而后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间相互作用的模式。 DMS化学干扰的主要局限性是，它只能使G残基甲基化。尽管如此，它仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹区段中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。 具体操作如下页图所示。 G G G G G G m Ⅰ G G G Ⅲ m G G G m Ⅱ G G G m Ⅱ G G G m Ⅰ G G G Ⅲ m DNA 局部甲基化 与蛋白质提取物混合 与蛋白质结合 不与蛋白质结合 与蛋白质结合 凝胶电泳 与蛋白质结合的DNA带含有Ⅰ和Ⅲ两种类型DNA片段 不能与蛋白质结合的DNA带含有全部三种类型DNA片段 切除所有结合与不结合蛋白质的DNA带，并用六氢吡啶切割甲基化的G残基 结合带 非结合带 缺失的DNA带表明相应G残基的重要意义，它得到结合蛋白质的保护 甲基化干扰实验 4、体内足迹实验 G G × G G × me G G G G Me Me 完整的细胞 裸露的DNA DMS 硫酸二甲酯 分离DNA并用六氢吡啶切割 凝胶分析 PCR扩增 受保护的G残基 应用甲基化保护作用进行的体内足迹实验 DNA核苷酸序列分析 传统的DNA序列分析法： Sanger双脱氧链终止法和 Maxam-Gilbert化学分析法 新发展的DNA杂交测序法 PCR技术的应用： 1.基因组克隆 突变体的鉴定和在PCR过程中有目的的添加核算序列。 反相PCR(reverse PCR)与染色体步移 不对称PCR(asymmertric PCR) 用来制备单链的DNA 特点： 两种引物的浓度不同，低浓度的限制引物和高浓度引物，两者浓度相差约100倍。 获得单链核苷酸的另一种方法是通过固相支持物作DAN链的特意洗脱。（生物素—链霉素包裹的磁珠） RT－PCR: 在mRNA反转录之后进行的PCR 检测RNA分子； 获取测序模板DNA； 克隆mRNA之cDNA拷贝。 基因的体外诱变 基因组的比较研究： 10个碱基作引物 用随机引物扩增出的PCR产物，经琼脂糖电泳后所呈现的带型，反映着用作模板的DNA分子的总体结构特征。 核酸分子杂交（DNA/DNA or DNA/RNA）技术 核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（Cavnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。  杂种核酸分子： 彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，而形成的双链分子。 DNA/DNA的杂交作用 检测特定生物有机体之间的亲源关系 DND/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片断中某种特定基因的位置。 核酸杂交常用几种膜的性能比较 硝酸纤维素膜 不能滞留小于150bp的DNA片断，不能同RNA结合。 应用1mol/L醋酸铵和0.2mol/L的NaOH缓冲液代替SSC缓冲液可改善对小片断DNA的滞留能力。 RNA变性后也能十分容易的结合到膜上。 尼龙膜或硝酸纤维素膜杂交的步骤： 1. 核酸印迹转移：将核酸样品转移到固体支持膜上。利用的是毛细管作用 2. 印迹杂交： 将具有核酸印迹的滤膜同带有标记的DNA/RNA进行杂交。 1、萨瑟恩DNA印迹杂交 根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫Southern DNA 印迹转移技术。 印迹转移前的