基因组测序基本原理教材.pptVIP

基因组测序 生物信息系列讲座之二 大纲 I. 核酸DNA的发现以及测序历史简介 II. 双脱氧化(Sanger dideoxy method)测序 III.大片段的DNA测序与基因组测序的大发展 VI.人类基因组 V. 1000美元个体化基因组测序计划(The “$1,000 dollar genome) Part I.核酸测序原理 DNA测序的方法 双脱氧法 (Sanger dideoxy) (primer extension/chain-termination) method: 最流行也是最广为接受的方法。 Maxam-Gilbert化学剪切法(chemical cleavage method): DNA is labelled and then chemically cleaved in a sequence-dependent manner. This method is not easily scaled and is rather tedious 焦磷酸测序(Pyrosequencing): measuring chain extension by pyrophosphate monitoring。焦磷酸测序技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便，可以快速、准确地确定DNA序列。 Sanger 双脱氧测序原理 Sanger 双脱氧测序原理 Sanger 双脱氧测序原理 如何读取这些DNA片段？ 同位素标记 同位素标记的引物 (如 32P) 同位素标记的dNTPs (如35S 或者 32P) 测序结果分析 目前一般采用凝胶电泳法分析-能够比较好的将每一条dNTP产生的DNA条带分离开。 DNA测序的实例样本 一个带有28个DNA样品的胶图: 绿带：碱基A，,蓝带 C, 黄带G，红带 T. 越小的片段跑得越快 自动测序仪 测序的趋势 Part II.大片段DNA测序与基因组测序的大发展 蜜蜂基因组是如何获得的？ 基因组文库的建立 目前基将基因组片段打碎建立文库。基因组文库含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体。 大片段载体 Lambda phage 插入大小: 20–30 kb Cosmids 插入大小: 35–45 kb BACs and PACs (bacterial and P1 artificial chromosomes (Viral) respectively) 插入大小: 100–300 kb YACs (yeast artificial chromosomes) 插入大小: 200–1,000 kb 大片段插入载体 Lambda 噬菌体 以及 cosmids 插入稳定 但插入片段的容量可能不足以做大规模的测序 YACs 能够插入大片段 但不太稳定，比较难实际操作 BACs and PACs BACs and PACs 大规模测序通用质粒 对插入片段大小比较合适，而且容易使用 与其它正常质粒一样能够扩增和分离 全基因组鸟枪法测序 但是片段比较大时，如在基因组测序时，仅仅由Sanger方法并不合适，因此Shotgun测序，将基因大片段打碎后测序。鸟枪法战略（Shotgun Strategy）又称随机测序战略，是由美国塞莱拉遗传公司创始人克雷格?文特尔发明，主要针对大片段的全长测序。因为整个基因组太长而每次只能测得一个500的小片断(read)。 鸟枪法测序步骤 第一，建立高度随机、插入片段大小为2kb左右的基因组文库。克隆数要达到一定数量，即经末端测序的克隆片段的碱基总数应达到基因组5倍以上。 第二，高效、大规模的末端测序。 第三，序列集合。 第四，填补缺口。 鸟枪法测序简要 重叠群Contigs 重叠群是指一组相互重叠的染色体DNA序列 如何建立重叠群基因克隆？ For sequencing one wants to create “minimum tiling path” Contig of smallest number of inserts that covers a region of the chromosome 限制性酶切产生不同的重叠群Contigs 通过限制性内切酶酶切 将重叠片段序列排列 直到建立一个完整的contig 两种不同的全基因组鸟枪法测序 序列拼接与组装 独立的测序片段(read)通过逐步把它们拼接起来形成序列更长的重叠群(Contig)，直至得到完整序列的过程称为重叠群装配(Scaffold)。目前DNA 序列拼接应用的主要软件是由美国华盛顿大学Phil Green实验室开发的Phred Phrap Consed系统。目前36个国家900 多个实验室都在使用上述系统。非赢利研究机构