2011-小学期-09七年制基因组-王丽华.pptVIP

* 真核细胞DNA的分离提取 及酶切电泳 生物化学：王丽华 实验安排 1、上午：基因组DNA的提取 2、中午：酶切 3、下午：琼脂糖凝胶电泳鉴定 移液器 微量分析 1、根据取样量，选择合适量程的加样器。 2、如何调节？ 顺时针调节--- 读数变小 逆时针调节--- 读数变大 注意：调节前，加样器读数正处于最大量程或最小量程时，如果向错误方向调节，马上会超出量程，将会损害加样器的精度。 （1）吸头的安装要紧密。 （2）打到第一挡，将吸头插入液面下适当 深度，缓慢松开拇指，吸取液体。拇指完全放开后，吸头在液面下停留一下（约半秒钟） （3）将外壁液体用容器口引流回容器。吸头内的体积应大致正确。（5）贴目的容器内壁，加样器推到第二挡。将液体匀速打到目的容器内， 观察吸头内液体是否完全打出。 台式高速离心机 centrifugation 离心 1、打开电源。 2、盖紧盖子,防止离心机被腐蚀。 3、标记，配平, 对称放入离心机(管的连接处朝外). 4、设定离心的转速和时间 5、统一离心。 废液 废头 污染废物 污物处理 实验步骤 第一部分：裂解细胞膜、提取白细胞核 第二部分: 裂解核膜，释放基因组。 第三部分：去蛋白 第四部分：乙醇沉淀DNA 第五部分：酶切，DNA电泳 (标管号) 1 抗凝血--0.3ml 。 2 STMT--1ml，充分颠倒混匀（酒红色）。 3 10,000×g 离心 2min，弃上清，倒置于滤纸。 4 生理盐水--0.4ml, 混匀, 10,000×g离心2min,弃上清。 5 NE溶液--450μl 悬浮沉淀。 6 10%SDS--50μl 迅速混匀， 蛋白酶K--50μl，轻轻摇匀， 水浴1h（50℃）。 7 TE饱合酚--500μl，轻摇 2min， 10,000×g离心 1min， 上层水相移至另一Ep管（用100μl枪×？次）全取。 8 酚－氯仿－异戊醇（25:24:1）500μl，轻摇 1min， 10,000×g离心 1min， 上层水相移至另一Ep管（用100μl枪×？次）全取。 9 氯仿－异戊醇（24:1）500μl，轻摇 1min， 10,000×g离心 1min， 上层水相移至另一Ep管内 (用100μl枪×？次)计量。 10 NaAc-- v，混匀 （离心机甩下）。 11 无水乙醇 -- 2倍v，混匀，－70℃ 15min。 10 1 12 10,000×g离心 5min，弃上清。 13 滤纸条吸残液，室温干燥 10min。 15 DNA液 -- 8μl，EcoRⅠ --1μl (提供内切酶反应最适条件) 10×TE缓冲液 --1μl 37℃水浴 60min 14 加双蒸水 -- 20μl，溶解沉淀 8μl：酶切 12μl：电泳对照 真核细胞DNA的分离提取 及酶切电泳 第一部分 DNA的分离提取 第二部分 电泳检测 掌握人外周血基因组DNA的提取原则和方法 实验目的 掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法 (Genome) 样品：人外周血 白细胞核中DNA 1步 抗凝血 2步 STMT溶液 3步 离心，弃上清，倒置于滤纸 4步 生理盐水 混匀, 离心 ,弃上清 一、裂解细胞膜提取细胞核 二、裂解细胞核膜释放基因组 （准备保护DNA） 5步 NE溶液 NaCl（高浓度Na+） EDTA 抑制DNase 破坏核膜 6步 SDS溶液 三、DNA与蛋白质解离 6步 蛋白酶K：消化组蛋白 （除去残存的酚及蛋白） 离心 ，取上层水相移至另一Ep管； （用100μl枪×？次）全取计量。 7步 TE饱合重蒸酚 8步 酚/氯仿/异戊醇（25:24:1） 9步 氯仿－异戊醇（24:1） 四、DNA的纯化 去除蛋白等 乙醇 + 盐 五、DNA的浓缩 沉淀法 10步 NaAc-- v，混匀 （离心机甩下） 10 1 11步 无水乙醇 -- 2倍v，混匀，－70℃ 15min。 （低温利于沉淀） 12步 离心，弃上清 13步 滤纸条吸残液，室温干燥 降低DNA的溶解度，稳定DNA分子 1 简化操作步骤，缩短提取过程 2 减少化学因素对核酸的降解 （pH4～10） （减少破坏因素） 3 减少物理因素对核酸的降解 4 防止核酸的生物降解 机械剪切力： 高速震荡；快速狭长孔道；反复冻溶… 高温： 常规操作温度为0～４℃ *