2015 Day2 基因重组与基因组提取.pptVIP

Day2基因重组与基因组提取 基因工程中，我们通过载体携带基因进入宿主细胞进行扩增和表达。 载体必须具备的条件： 1.复制起点 2.利于检测的遗传表型(抗生素筛选等) 3.限制性酶切位点 4.适当的拷贝数 载体种类：质粒、噬菌体、病毒等。 质粒发现于细菌、放线菌和真菌细胞中 染色体外的稳定遗传因子 多数为双链、闭环的DNA分子 超螺旋状态存在于宿主细胞中 它具有自主复制和转录能力 质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质 质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。 质粒(Plasmid) 蓝 / 白斑筛选通过使用弱组成型大肠杆菌启动子 ( tet ) 驱动 lacZ a - 肽表达而实现，而目标基因表达由相反方向的 T7 启动子驱动。 质粒pETblue-2（3.6kb）图谱 DNA 重 组－酶切和连接 限制性内切酶产生的末端 粘性末端——识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为匹 配粘端 GAATTC CTTAAG 平末端——在回文对称轴上同时切割 DNA 的两条链，则产生平末端 GGCC CCGG 内切酶的选择 5’NNGOH pGATCCNN3’ 3’NNCCTAGp HOGNN5’ BamHⅠ Hind III + 370C酶解1小时 每人质粒和PCR产物各1管 酶切结果的电泳 1%琼脂糖凝胶 30mL (用1xTAE配) 1.5uL GoldView 酶切DNA（质粒和AKP） 全部上样+ 6xloading 未酶切质粒DNA 2uL + 1uL 6xloading Marker 6uL 80伏恒压电泳，结果用凝胶成像仪分析照相 M 未切 部分 完全 AKP 完全切开条带胶回收，回收方法与之前相同，最后溶解DNA液体加30uL/条带。 回收产物紫外分光光度计测量浓度 连 接 反 应 体 系（ 25 uL ） 目的基因AKP 载体 pETBlue-2 10 x Ligase buffer ddH2O T4DNA连接酶 X uL Y uL 2 uL Z uL 1.5 uL 控制载体和目的基因的比例为1：3－10 160C连接过夜 －200C保存，用于转化受体细胞 小鼠基因组DNA的提取 小鼠基因组DNA的提取 每组0.2g鼠肝，冰冷生理盐水洗净血液，剪碎 ? 碎鼠肝转入玻璃匀浆器中，加入2mL匀浆液，匀浆至无明显组织块 （冰上操作） ? 匀浆液转入2mL小指管，4℃ , 5000rpm离心2min, ? 沉淀加0.8mL无菌水，吹散，分成两份，再加0.4mL酶解液，慢慢颠倒混匀 ? 55℃水浴酶解过夜 ? 注: 基因组DNA易 被机械剪切! 待续 配试剂 1. 0.1mol/L的CaCl2 100mL／两组 2. LB液体培养基 80mL 胰蛋白胨（typtone) 0.8g 酵母提取物（yeast extract) 0.3g NaCl 0.8g 先加80mL水溶解后，再加16μL 5mol/L NaOH，分装到两个250mL锥形瓶。 （分装四个试管培养基，3ml/管；其中一个明天复苏中使用） 灭菌 1. 试剂1和2 2. 小指管： 1.5 mL 30个 3. 枪头： 200uL 1盒（部分扩口） 1mL 1盒（部分扩口） 5 mL 8支 4. 50 mL离心管 4套 5. 直径9cm的平皿6套 预培养：接NovaBlue单菌落到含12.5ug/mL Tet(四环素)的3mL LB培养基中，每组三管。370C、190rpm振荡培养过夜 下午4:00 无菌操作 一、无菌操作准备工作 酒精灯（酒精量不少于三分之一，不多于三分之二）； 酒精棉球是否充足； 需要使用的枪、枪头盒等放入后照紫外20-30分钟； 关掉紫外灯，打开风机，点燃酒精灯； 二、培养基加入抗生素，摇匀 三、枪头挑取菌落后，直接将枪头打入培养基中 四、试管加盖，放入恒温摇床中培养过夜 五、清理无菌操作台 明天实验 感受态细胞制备 重组质粒转化克隆菌株 涂板筛选 基因组提取