寡核苷酸芯片技术讲述.pptVIP

姜振玲 一、基因芯片概念 基因芯片（gene chip）又称DNA芯片，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段有序地、高密度地排列固定于支持物上，待测样品核算分子经过标记，与固定在载体上的DNA阵列中的点按碱基配对原理同时进行杂交。杂交形式属于固液杂交。通过激光共聚焦荧光检测系统进行扫描以获取样品数量和序列信息。 二、基因芯片的主要特征 高通量－－提高信息量 平行化－－提高信息的可比性 微量化－－降低待测样本的用量 自动化－－提高工作效率 低成本－－可迅速普及推广 三、基因芯片分类 cDNA芯片 寡核苷酸芯片 寡核苷酸芯片和cDNA芯片的比较 比较内容 寡核苷酸芯片 cDNA芯片 DNA类型 寡核苷酸 cDNA DNA长度 小于80碱基 500-3000碱基 DNA链 单链 双链 DNA制备 预合成或原位合成 PCR产物 连接方式 共价键 共价键或离子键 应用 基因表达谱、突变等 基因表达谱 四、寡核苷酸芯片的特点 序列经过优化，减少非特异杂交，能有效区分有同源序列的基因； 减少二级结构； 杂交温度均一，提高杂交效率； 合成产物浓度均一，避免因样品浓度差异而造成的点样量差异； 无需扩增，防止扩增失败影响实验 五、寡核苷酸芯片分类 根据寡核苷酸应用方向的不同，可将其分为两类： 表达谱芯片：用于检测基因的表达状况（我公司目前使用的illumina表达谱芯片即为此类） 检测芯片: 用于检测特定基因是否存在（我公司使用的DRB检测芯片为此类） 六、寡核苷酸芯片的技术原理 1.寡核苷酸表达谱芯片的技术方法流程： 寡核苷酸探针的合成及纯化 与载体基片通过化学反应连接 对照组样本 杂交 激光共聚焦扫描检测及数据统计 筛选不同处理后表达的差异基因 实验组样本 RNA分离 RNA反转录扩增标记 完整RNA检测:直接杂交 探针 Biotin 标记 cRNA 地址序列 * * * * * * * * * * 23 mer 50 mer 微珠 50mer 基因特异性探针 每个微珠连接有近百万探针 每种类型微珠～30倍重复 探针设计:生物信息学分析挑选几个候选探针,动力学反应扫描确定(专利) Scanned Image and Data output analyzed with BeadStudio 2、寡核苷酸检测芯片技术方法流程 寡核苷酸探针的合成及纯化 与载体基片通过化学反应连接 杂交 检测及数据分析 处理标本 （外周血或口腔粘膜） 提取基因组DNA PCR扩增并用引物标记