Westernblot详细过程解说.ppt

转膜的注意事项（二） 避免直接用手碰杂交膜，使用镊子。因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。 夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全。 保证膜和滤纸的大小和凝胶完全一样，过大和过小都会影响转膜效率。 鸡来源的抗体与PVDF和尼龙膜有较强的结合能力，从而产生较高的背景，故如果选择鸡来源的抗体最好使用硝酸纤维素膜（NC膜）。 关于磷酸化蛋白检测的注意事项： 保持待测蛋白处于磷酸化状态！在标本提取液中加入足够的磷酸酶抑制剂（NaF，可以防止去磷酸化），并将标本时刻保持在冰浴中！ 使用5%的BSA作为封闭试剂！不能使用脱脂奶粉!（因为脱脂奶粉中含有酪蛋白，会出现很高的背景。） 请谨记蛋白的磷酸化是需要诱导的！当信号低或者无信号时有可能是磷酸化诱导不充分！确保使用阳性对照！ 抗体保存注意事项： 1. 收到抗体后按要求离心后再打开管盖进行分装和保存！ 2. 对于大部分抗体，比较合适的保存方式是分装后保存在 -200C。 2.1 分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于10ul每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响。 2.2 复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在40C，避免再冻起来！ 2.3 绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。 3. 大部分抗体收到后4