第九章DNA序列测定教材.pptVIP

第九章 DNA序列测定 第一节 概 述 一、DNA序列测定 三、核酸序列分析的目的意义和策略（具体方法） 四、测序的常用方法 （五）用于测序的变性凝胶电泳 胶长40cm，厚度均匀 4~8%丙烯酰胺 7mol/L尿素 四、大片段DNA的测序方法 （一）随机法 超声波处理：将DNA随机断裂成一组相互重叠的300~900bp片段，电泳回收300~600bp片断作亚克隆 DNaseI切割：将DNA随机切割成一组相互重叠的片段，作亚克隆 限制酶消化：限制酶将DNA切割为含粘端的DNA片段，作亚克隆将上述含不同子片段的亚克隆扩增后进行测序 （二）嵌套缺失法 一、化学裂解法测序的原理 1、用放射性核素标记待测DNA一侧末端 2、将标记DNA分为G、A+G、C+T、C 4个反应体系 3、用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物 4、电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即可读出DNA序列 三、化学裂解法的特点 不需酶催化 5 ′和3 ′端均可标记，可从两方向测同一DNA 操作繁琐、费时、分辨率较低 第三节 DNA测序自动化和大规模测序 特点 原理同末端终止法 标记物为荧光染料 激光扫描自动测序 结果清晰、准确、分辨率高 测序速度快 200bp/h DNA自动测序与手工测序的不同点 1、标记物不同：手工测序采用放射性核素标记，而自动测序采用4种荧光染料分别标记ddNTP或标记引物 2、加样方式不同：手工测序，一个样品的4个测序反应物分别在不同泳道进行，而自动测序可在一个泳道内电泳 3、检测手段不同：手工测序采用放射自显影，从4种寡聚核苷酸的梯子形图谱中读出DNA序列，而自动测序则采用激光扫描器同步扫描，计算机进行阅读和编辑 四、化学法读序 化学法测序放射自显影图谱的识读，较末端法更复杂一些，这是因为化学裂解反应并不完全是碱基特异性的，每组测序图谱为4或5条垂直的阶梯带，AC反应可以不做。该片从胶底部一个个向顶部读，G+A和C+T两列中含有所有相差一个碱基的DNA片段。如果G+A中出现1条带就看G列中是否有同样大小的带，若有即为G碱基，无则为A碱基；同理，C+T中则检查C列中有无同样大小条带，有即为C，无则为T。在做了AC反应时，出现较深的带时，可以帮助确定为A碱基。化学法必须4或5个反应管统一阅读，DNA中4个碱基每个位置都有1个相应的片段，待测的DNA全部序列可直接读出。（专业技术人员） 化学法测序采用32P标记DNA进行，条带会较末端法更模糊，更宽，由于分辨率不足，从单块凝胶上能得到可靠序列数量约为200-300bp以内。读序常见问题及解决办法参见分子克隆P665。 末端法读序（分子克隆P640） * * 即核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。 　　 1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰岛素51个氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事。70年代后期，Sanger和MaxamGilbert等人又建立了核酸序列测定的方法，Sanger双脱氧末端终止法和MaxamGilbert化学裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读”阶段，使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。 二、DNA序列测定工作原理 在四种反应体系中，寡聚核苷酸分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基，将待测DNA片段转变成一系列放射性核素标记的单链DNA片断，并使其一端为一固定的末端，而另一端由于长度不同，成为一系列相差1个碱基的连续末端。经电泳分离，放射自显影，可直接读出DNA的序列。 （一）序列分析的目的，2种： 1、确证性测序 通过测定对突变进行定位和鉴定，应用时测定野生型基因上同源区和突变体的相应序列直接在一张胶片上比较二者序列差异。（已知基因序列） 2、从头序列 目的是提供一段DNA准确的核苷酸序列。（未知基因序列） （二）测定在生物医学领域相应应用，2个方面： 1、对已知基因序列检查，特别是有遗传倾向的病例检测相关基因有无突变，有助于阐明疾病发病机理及建立相应诊疗方案。 2、对已经克隆的未知序列进行测定，从而阐明该基因的一级结构，如人类基因组计划中大量的工作是要阐明克隆片段的核苷酸的排列顺序。 （三）序列分析的策略（具体方案） 测序目的不同或靶