分子生物学学生实验.pptVIP

实验十 质粒DNA的提取 试剂：LB培养基、Amp+、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、 3M NaAc、TE。 仪器及耗材：移液器、Tip头、冰盒、冰箱、离心机、水浴、 酒精灯、培养箱、摇床。 实验流程 取1.5 mL菌液 1.5 mL EP管 弃上清 100 μL溶液Ⅰ 12000 r/min 10 min 加入 4℃ 4000r/min 1min 200 μL溶液Ⅱ 取上清至新管 室温10 min 2倍体积的无水乙醇、1/10体积的NaAc 离心 室温5 min 150 μL溶液Ⅲ 室温3 min -20℃ 30min 12000 r/min 10 min 弃上清 70% 乙醇1 mL 洗盐 沉淀溶于50 μL TE 实验十 质粒DNA的酶切鉴定 试剂：pst Ⅰ及Buffer、标准分子量、电泳试剂一套 仪器及耗材：金属浴、移液器、Tip头、冰盒、冰箱、电泳一套。 实验流程 质粒DNA 1-2 μL pst Ⅰ 1 μL 10×Buffer 2 μL H2O 15-16 μL 10 μL电泳检测 分析外源DNA片段的大小 pUCm-T载体的图谱 实验十一 动物组织总RNA的抽提 试剂：氯仿、异丙醇、DEPC乙醇、Trizol试剂、液N 仪器及耗材：超净工作台、研钵（DEPC处理）、移液器、Tip头 （RNase free)、Ep管（ RNase free)、冰盒、冰箱、 离心机。 实验流程 组织块 研钵 加入Trizol 1mL 12000 r/min 15 min 快速研磨至粉末 移入Ep管 取上清至新管 完全溶化 加入与上清等体积的异丙醇 超净台 室温5 min 200 μL氯仿 室温5 min 12000 r/min 10 min 弃上清 75% 乙醇1 mL 洗沉淀 溶于100 μL DEPC水中 振荡混匀 4℃ 室温10 min 4℃ 实验十二 RNA浓度的测定与反转录 试剂：模板RNA、Oligo(dt) primer(50μM)、RNase free dH2O、 DEPC乙醇、5×M-MLV buffer、dNTP Mixture(各10 mM）、 RNase Inhibitor(40U/μl)、RTase M-MLV(RNase H-)(200U/μl) 仪器及耗材：超净工作台、金属浴、移液器、Tip头 （RNase free)、Ep管（ RNase free)、冰盒、冰箱、 离心机。 实验流程 RNA样品 稀释50倍 测定OD260值 紫外分光光度计 计算RNA浓度 冰上2 min后加入 70℃ 10 min Oligo(dt) primer(50μM) 1 μl RNA 1 μg RNase free dH2O up to 6 μl 5×M-MLV buffer 2 μl dNTP Mixture (各10 mM) 0.5 μl RNase Inhibitor(40U/μl) 0.25 μl RTase M-MLV(RNase H-)(200U/μl) 0.25-1 μl RNase free dH2O up to 10 μl 42℃ 60 min 70℃ 15 min -70 ℃保存 RNA量（ μg/mL ）=OD260×稀释倍数×40 μg/mL RNA量的计算公式： 实验十三 PCR检测(A3)cDNA质量 试剂：A3引物、dNTP、Tag DNA聚合酶、10×PCR buffer、琼脂糖、 TBE、EB（1 mg/mL)、ddH2O、DNA上样缓冲液、 DNA标准 分子量 仪器及耗材：PCR仪、电泳仪及电泳槽、制胶槽、微波炉、三角瓶、 Tip头、 冷藏盒、冰箱、1.5 mL离心管、废液缸、吸水 纸、凝胶成像系统、水平仪。 材料：RNase处理过的家蚕基因组DNA 实验流程 PCR试剂完全溶化 做1%琼脂糖胶 PCR产物8 μL 上样缓冲液2 μL 混和后上样 电泳40-60 min 拍照片 25 μL P1 0.5