实验12 单增李斯特菌感染对小鼠脾脏ANAE+淋巴细胞的影响.pptVIP

实验十一 单增李斯特菌感染 对小鼠脾脏ANAE+淋巴细胞的影响 一、单增李斯特菌 单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes, LM)，简称单增李斯特菌,是重要的食源性人兽共患胞内寄生 菌，2002年被WHO列为仅次于大肠杆菌O157、沙门氏菌、志贺 氏菌的第四大重要的食源性致病菌。该菌主要感染新生儿、孕 妇、老年人和免疫力低下人群，导致单核巨噬细胞数增加，欧 美已发生多次食物感染事件。 单增李斯特菌胞内感染模式 二、单核巨噬细胞 单核巨噬细胞是重要的免疫细胞，当机体感染病原时，单 核巨噬细胞数目会显著增加，以吞噬、杀伤、消化病原微生物。 三、实验原理 酸性α-醋酸萘酯酶（acid α-naphthyl acetate esterase,ANAE）为 细胞的溶酶体酶，T淋巴细胞浆中富含ANAE，该酶参与淋巴细 胞对靶细胞的杀伤作用。在弱酸性条件下，该酶能将酸性α-醋 酸萘酯水解成醋酸和α-萘酚，α-萘酚与六偶氮副品红偶联， 生成不溶性的红色沉淀物，沉积在T淋巴细胞浆中该酶所在部 位，经甲基绿复染，呈现单一或散在的颗粒或斑块，呈棕红色， B淋巴细胞无此反应，该方法可作为T淋巴细胞的鉴别方法之一。 四、实验目的 （1）了解单核巨噬细胞的基本功能 （2）了解细菌感染与单核巨噬细胞增多之间的关系 （3）单核巨噬细胞染色的原理和染色方法 1：制备BHI液体和固体培养基，分别分装试管和倾倒平板。 2：保存的单增李斯特菌菌种（以下简称细菌）10μl，接种2支5ml BHI液体培养基，37℃培养过夜，以复苏细菌。 3：划线固体平板培养基，37℃培养2天。 4：挑单克隆，接种液体培养基，37℃培养过夜。分光光度仪测定培养物的OD600，以空白BHI调零。按OD600为1时，1ml培养物中含细菌数为1X109计算，将培养物用BHI分别稀释为1X104/ml、1X103/ml、1X102/ml和BHI空白对照（每组做一个稀释度，每组一只小鼠），各1 ml即可。 5：每只Balb/C小鼠尾静脉接种100μl, 其中分别含1X104/ml、1X103/ml、1X102/ml细菌和BHI空白，饲养2-3天。 五、实验步骤 6：断颈致死小鼠，标记好小鼠（细菌接种数），酒精棉球消毒小 鼠，剖腹取脾脏，在平皿中用剪刀剪成4-5块，然后用镊子移放在 200目的铜网上。 7：在脾脏上加2ml细胞基础培养基MEM,用注射器芯轻轻研磨脾脏 至只有结缔组织时，再用少量MEM冲洗一下。 8：收集平皿中的细胞，用MEM平衡并离心，2000rpm，5min； 用2ml MEM悬浮细胞。 9：另取一空白离心管，其中加入2ml淋巴细胞分离试剂（聚蔗 糖-泛影葡胺），用移液器吸取上述悬浮细胞，沿管壁近液面处缓 慢加入，不要破坏液面平衡。2000 rpm, 离心10min.轻轻取出离 心管（不要剧烈），可见分层（从上到下依次为MEM、交界处的 淋巴细胞、淋巴细胞分离液，沉淀为红细胞和碎片），取淋巴细 胞层，加MEM至3ml， 2000rpm 5min,1ml MEM 悬浮。 。 10：取淋巴细胞涂布于载玻片（涂薄便于凉干），室温凉干后， 滴几滴2.5%戊二醛，固定10min后，蒸馏水冲洗 （不要冲细 胞），用吸水纸将样品周围吸干，室温干燥。 11：将固定后的干燥涂片浸入已在37℃水浴箱中预热60分钟的 孵育液中孵育30分钟，为了尽量去除孵育液中可能的沉淀和气泡 附着在涂片上，在孵育到25分钟时，用镊子将涂片在孵育液中轻 轻抖动，再孵育5分钟后，蒸馏水冲洗，用吸水纸将样品周围吸 干，室温干燥。 12：滴加1%甲基绿于涂片上，染色60-70S，蒸馏水冲洗，用吸 水纸将样品周围吸干。 13：用油镜检查计数200个淋巴细胞，统计在此200个淋巴细胞 中ANAE阳性的细胞数目，计算染色百分率，并选择好的视野 拍照。 15：Immunogenic封胶树脂封存典型染色图。 16：各组将解剖后小鼠集中到助教处，接种细菌数量相同的小鼠为一组。 谢 谢！ * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *