第九章：基因敲除与药学+张敏.pptVIP

基因敲除技术与诺贝尔奖 3. 具有一个以上的遗传标志，便于对基因重组的ES细胞进行筛选。 常用的筛选标记为正负筛选：Neo（新霉素磷酸转移酶）基因阳性筛选标记和HSV-tk（单纯袍子病毒 胸腺嘧啶激酶）基因阴性筛选标记。 基因敲除载体导入ES的方法有显微注射法，电穿孔法，DEAG葡聚糖介导法，脂质体法，病毒感染法，精子载体法等 三、基因捕获 基因诱捕所用的载体一般由报告基因、选择性标记基因及辅助元件组成。 报告基因缺乏自身的某个表达调控序列，在捕获内源基因的相应表达序列后获得表达。 根据所诱捕的表达调控序列的不同，广义的基因诱捕包括： 增强子诱捕、基因诱捕、启动子诱捕、poly（A）诱捕。 四、RNAi引起的基因敲除 RNAi引起的基因敲除 RNAi引起的基因敲除 RNAi引起的基因敲除 ④：上述复合物同与互补的mRNA结合，促进mRNA被RNA酶裂解，并且以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链，并在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。 ⑤：这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。 五、基因敲除的应用 1.基因敲除和转基因技术是研究基因的结构功能和其他生命科学理论问题的重要工具。 2．建立生物模型。 基因敲除技术就常常用于建立某种特定基 因缺失的生物模型，从而进行相关的研究。这些模型可以是细胞，也可以是完整的动植物或微生物个体。最常见的是小鼠，家兔、猪、线虫、酵母和拟南芥等的基因敲除模型也常见于报道。  3.基因敲除和转基因技术为人类疾病的基因治疗提供有力手段。 使用基因工程技术将外源基因导入患者的病变细胞，纠正机体基因缺陷或调节基因表达功能是细胞重新获得正常的功能，这个过程称为基因表达。 4.基因敲除和转基因技术通过改造生物体基因，可以用于研制优良的生物反应器，培育新的生物品种和提供异种器官移植的供体动物。 随着基因敲除技术的发展，早期技术中的许多不足和缺陷都已经解决，但基因敲除技术始终存在着一个难以克服的缺点，即敲掉一个基因并不一定就能获知该基因的功能， 其原因包括： 一方面，许多基因在功能上是冗余的， 敲掉一个在功能上冗余的基因，并不能造成容易识别的表型，因为基因家族的其他成员可以提供同样的功能； 另一方面，对于某些必需基因，敲除后会造成细胞的致死性，也就无法对这些必需基因进行相应的研究了。 基因敲除技术的缺陷 南京农业大学 生命科学学院 * 第九章：基因敲除与药学 三位在基因敲除技术方面进行了卓越、开拓性工作并取得了显著成就的科学家分享了2007年诺贝尔生理或医学奖，他们是美国盐湖城犹他州大学的Marie Capecchi教授、美国北卡罗来纳州大学的Oliver smithies教授以及英国加蒂夫大学的Martin Evans教授 基因敲除简介 定义：通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。 1234567 123456790 8 90 RNAi 同源重组 插入突变 基因敲除（gene knock-out） 通常所说到的基因敲除，又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重 组，进行精确的定点修饰和基因改造，把具有功能的同源序列置换出来，造成功能基因的缺失或失活。 应用DNA同源重组原理进行基因敲除 同源重组 插入突变 RNAi 同源重组 插入突变 发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 要有将外援基因导入宿主细胞的载体 2.能接受外援基因的受体（常用胚胎干细胞） 基因敲除的必备条件 基因敲除载体 通常，我们将外源基因DNA片段通过相应载体导入ES细胞中，一个好的载体应具备以下特点： 能在宿主细胞中稳定存在 2.具有多个限制性内切酶的单一酶切位点，即 multiple cloning site(MCS),便于外源基因的插入。常用质粒。 Neo新霉素基因阳性的ES细胞可以再含有G418（一种新霉素的类似物）的培养基上生长。 HSV-tk基因阳性的ES细胞，编码的基因产物可以将更昔洛韦等转化为有毒物质，将细胞杀死。 胚胎干细胞（简称ES细胞） 胚胎干细胞是早期胚胎