第七章 层析2.pptVIP

⑷凝胶粒径：凝胶一般为球形,其粒径大小对分离度有重要影响,粒径越小，理论板当量高度越小,分离效率越高。 ⑸床体积:即1g干燥凝胶溶胀后所占有的体积。 ⑹空隙体积：层析柱中凝胶之间空隙的体积，即V0值。空隙体积可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定，一般使用平均相对分子质量为2000kD的水溶性蓝色葡萄聚糖。 2.1 凝胶过滤层析 3)影响分离的因素 1.线速度: a.HW40F凝胶的排阻极限小，在该凝胶中蛋白质的m = 0，故HETP = 2Dz/u ,由于Dz ∝udp) 故层析柱的理论板当量高度为常数。 b.HW55F凝胶的排阻极限较大,在此，m 0,在忽略Dz影响时, HETP∝ u 。 2.料液体积: a.在一定相对料液体积范围内，HETP为常数 b.之后在增加料液体积，HETP随料液相对体积的增加而急剧增大 c.意义：为得到较高的分离度，料液体积需根据溶质的m差别控制在适当的范围内，在不影响分离度的前提下取最大值 3.料液浓度： 依据GFC的原理，tR和HETP与浓度无关。但实验表明，当浓度较高时，洗脱曲线出现吐舌、拖尾、甚至双峰；使HETP极度上升。这主要为样品黏度高造成。经验表明，料液与流动相的黏度比应控制在2以内。 4.相对分子质量与分配系数配比： a.在GFC分级范围内m与M关系: m=a-blogM 此时，分离度方程为 方程式：b值越大，即凝胶分级范围越小，Rs越大 b.因此，一定料液时，根据组分的M选择分级范围较小的介质，利于提高Rs和料液的处理量. 5.凝胶微粒： a. dp↓, HETP↓.故dp↓是N↑的最佳途径； b. dp↓10倍, 而h和v不变，u↑10倍，HETP(=h dp) ↓10倍，分离度也随之提高; 4)凝胶过滤层析特点 操作简便,凝胶过滤介质相对价廉易得,适用于大规模分离纯化过程。因此，GFC在 生物大分子的分离纯化过程中最为普遍，尤其被广泛应用于分离纯化的初级阶段及最后成品化前的脱盐。 优点： ⑴溶质与介质不发生任何形式的相互作用,因此可采用恒定洗脱法洗脱展开，操作条件温和，产品收率可接近100%。 ⑵每批分离操作结束后不需要进行介质的清洗或再生，故容易实施循环操作，提高产品纯度。 ⑶作为脱盐手段，GFC比透析法速度快，精度高；与超滤法相比，剪切应力小，蛋白质活性收率高。 ⑷分离机理简单，操作参数少，容易规模放大。 (5)操作简便，介质价廉易得；适合于大规模生产 缺点： ⑴仅根据溶质之间相对分子质量的差别进行分离，选择性低，料液处理量小。 ⑵经GFC洗脱展开后产品被稀释，因此需要浓缩单元操作。 2.2 离子交换层析 1)原理与操作 离子交换层析(IEC)： 利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱层析方法; 原理：荷电溶质在离子交换剂上的分配系数； 意义：对于蛋白质和氨基酸，调节I；调节|pH-pI|； 阳离子交换树脂：CM-纤维素（羧甲基纤维素），交换功能基团为氨基（－NH3+)，分离带正电荷的蛋白质。 阴离子交换树脂：DEAE－纤维素（二乙胺乙基纤维素），交换功能基团为羧基（－COO－)，分离带负电荷的蛋白质。 操作：层析操作多采用线性梯度法和逐次洗脱法，其特点： ⑴线性梯度洗脱法： 由于恒定洗脱缺点有洗脱体积大,溶质洗脱不尽 线性梯度洗脱法 优点：流动相离子强度连续增大，不出现干扰峰，操作范围广； 缺点：需要特殊的浓度梯度的设备，重复性差。 ⑵逐次洗脱法（梯度洗脱）： 优点：利用切换不同盐浓度的流动相溶液进行洗脱，不需要特殊梯度设备，操作简便； 缺点：因为流动相浓度不连续变化，容易出现干扰峰。此外，容易出现多组分洗脱峰重叠的现象，因此洗脱操作参数的设计比较困难。 操作：低盐结合，高盐洗脱，吸脱时，增加溶液的I，如改变pH，增加盐浓度，离子被取代而解吸下来 ２)离子交换层析特点 优点： ⑴料液处理量大，具有浓缩作用，可在较高流速下操作； ⑵应用范围广，优化操作条件可大幅度提高分离选择性，所需柱长较短； ⑶产品回收率高； ⑷商品化的离子交换剂种类多，选择余地大，价格远低于亲和吸附剂 缺点：IEC操作变量＞GFC 2.3 疏水性相互作用层析 1)原理 疏水性相互作用层析(HIC)是基于物质分子的疏水性基团与层析介质上的疏水基团相互作用在非极性的固定相和极性的流动相之间不断分配得以分离 首要条件：载体的活化与配基的偶联. 2)疏水性吸附剂 常用的疏水性配基主要有苯基、短链烷基（C－C）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。 疏水性配基与亲水性固定相粒子之间