第七章 动物生殖细胞工程.pptVIP

第七章 动物生殖细胞工程 主要内容 性别控制 体外受精技术 显微受精 第一节 性别控制 精子采集 精子品质检查 精液的稀释 性别控制 一、精子采集 采精方法：假阴道法；手握法采精； 电刺激法采精； 按摩法采精 采精频率：公畜每周采精次数 二、精液品质检查 外观：均匀,不透明,乳白色和灰白色,稍带有腥味 射精量：公畜每次射精后的精液容量 精子活率:直线前进运动精子数占总精子数的百分率 精子密度：单位容积的精液所含精子数量 形态检查：畸形率 顶体完整率 三、精液的稀释 1. 稀释液成分 平衡盐类物质：电解质离子 缓冲类物质：EDTA、柠檬酸钠溶液等 能量物质：卵黄、奶类和单糖等 冷冻保护剂：甘油、乙二醇和DMSO等 抗生素：青、链霉素、庆大等。 2. 稀释液种类 即用型：简单等渗液稀释即可。 常温保存型：常用于短期保存，PH值较低。 低温保存型：含卵黄、奶类等抗冷休克物质 冷冻保存型：成分复杂，含糖、卵黄、抗冻剂等物质。 四、性别控制 1. 意义 人类对不同的动物有不同的性别选择需要。 提高育种效率 控制X精子的隐性遗传病 第二节 体外受精技术 体外受精：指两性配子在体外人工控制的环境中完成受精，使之融合形成合子的一种辅助性生殖技术。 试管动物：将体外受精胚胎移植到母体后获得的动物。 卵母细胞的获取与成熟 精子的采集与获能 受精过程和原理 受精卵的体外发育培养 胚胎移植 一、卵母细胞的获取与成熟 生殖激素基础 超数排卵 卵母细胞获取的途径及方法 卵母细胞的分级与筛选 卵母细胞的成熟培养 1.生殖激素基础 发情周期：上次发情开始到再次发情开始时间 生殖激素调节：下丘脑-垂体-性腺轴 卵泡发育规律：募集-选择-优势化-排卵 2. 超数排卵 定义：在雌性动物发情周期的间情期，注射外源促性腺激素诱发其卵巢大量卵泡同时发育并排卵 超排激素：垂体促性腺激素（FSH、LH）、 PMSG 、hCG 、PGF2α、GnRH等 超数排卵的方法： ①促卵泡素(FSH)减量注射法 ②孕马血清促性腺激素(PMSG)处理法 3.卵母细胞的获取途径及方法 成熟的卵母细胞:从输卵管中获取，直接用于体外受精 未成熟的卵母细胞:卵巢中获取，体外成熟后用于体外受精 小鼠成熟卵母细胞收集 4. 卵母细胞的分级筛选 A:外围有3层以上致密卵丘 细胞，卵母细胞 胞质均匀 充满于透明带内 B:外围有1~3层致密卵丘细胞，卵母细胞胞质均匀； C:卵丘细胞分散，卵母细胞胞质不均匀； D:无卵丘细胞，卵母细胞胞质不均匀，且有暗斑 5. 卵母细胞的成熟培养（核成熟和质成熟） 卵母细胞选择: A级卵母细胞 成熟培养液: 基础培养液: TYH,TCM-199,DMEM等 促性腺激素: FSH,LH,PMSG,HCG等 类固醇激素: 如雌激素等 生长因子: 如EGF、TGF等 巯基类物质:半胱氨酸、谷胱甘肽等 蛋白添加物: FBS或卵泡液（猪） 成熟培养:采用微滴培养法： 微滴的制作 培养密度：10-15枚/100ul微滴 成熟时间：小鼠12h，牛、羊20-24h，猪36-42h，人6h。 二、精子的采集与获能 1.精子的采集 发生场所：睾丸 时间：初情期——生殖机能衰老 精子细胞——精子的形变过程 概念： 分子机制： 促进精子体外获能的物质： 方法：获能培养滴培养1-2h获能 精子获能的检测： 三、受精过程和原理 成熟卵母细胞和获能的精子在特定的培养环境中共同培养，使之融合形成合子而完成受精过程。 精子穿入卵丘和放射冠 精子与透明带结合 顶体反应 精子穿入透明带 精卵融合 卵子的激活 精子核在卵胞质内的解凝聚 原核形成 原核的融合 受精卵雌、雄原核的融合 2.多精受精的原因 受精浓度 卵子未能完全成熟 精卵作用时间，钙离子浓度等 四、受精卵的体外发育培养 将受精卵发育至桑椹胚或囊胚，因为移植这两个时期的胚胎才能获得较高的妊娠率，而且只有获得囊胚才能用于胚胎干细胞的分离培养。 发育阻滞 Bowman等（1970）发现了体外受精的哺乳动物早期胚胎存在着发育阻滞（developwent block）现象，正好位于母体-胚胎基因过渡期。 克服阻滞现象的方法 改进培养液成分，改善培养条件 中间受体培养法 利用与体细胞或体细胞条件液建立共培养体系 目前常用的共培养