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流式细胞术检测T细胞亚群 组 长： 杜建呈 小组成员： 李 姚 田 呈（讲解） 罗光珍 范成芬 钱洪珍 1956年，Coulter 在多年研究的基础上利用 Coulter 效应生产了Coulter 计数器。其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。 1967年 Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。 1973年 Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。这样就基本完成了现代FCM计数技术的主要历程。 现代的FCM数据采集和分析技术是从组织化学发 源的，其开拓者是Kamentsky。1965年，他在组织化学的基础上提出了两个新设想 1）细胞的组分是可以用光光度学来定量测定的，即分光光度术可以定量地获得有关细胞组织化学的重要信息。 2）细胞的不同组分可以同时进行多参数测量，从而可以对细胞进行分类。换句话说，对同一细胞可以同时获得有关不同组分的多方面的信息，用作鉴别细胞的依据。 流式细胞术在细胞化学中的应用的先驱者是Van Dilla 和美国的Los Alamos小组。他们在1967年研制出流液束、照明光轴、检测系统光轴三者相互正交的流式细胞计的基础上，首次用荧光Feulgen反应对DNA染色显示出DNA的活性与荧光之间存在着线性关系，并在DNA的直方图上清楚地显示出细胞周期的各个时相。Gohde 和Dittrich接着把这项技术推向实用，他们用流式细胞术测定细胞周期借以研究细胞药代动力学问题。FCM用于免疫组织化学中的关键是对细胞进行免疫荧光染色，其它和在细胞化学的应用并没有多大差异。 流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。 三，流式细胞术的基本原理及应用 一） 流式细胞术（FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。 1，其基本原理是将悬浮分散的单细胞悬液，经特异荧光染料染色后，放入样品管。 2，在气体压力的作用下，悬浮在样品中的单细胞悬液形成样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，沿流动室的轴心向下流动，流动室轴心至外壁的鞘液也向下流动，形成包绕细胞悬液的鞘液流，鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆柱流束，自喷嘴的圆形孔喷出，与水平方向的激光束垂直相交相交点称为测量区。 3，染色的细胞经照射发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别被呈900角方向放置的光电倍增管荧光检测器和前向角放置的光电二极管散射光检测器接收，经过转换器转换为电子信号后，经膜/数转换输入计算机。 4，计算机通过相应的软件储存，计算，分析这些数字化信息，就可以得到细胞的大小和活性，核酸含量，酶和抗原的性质等物理和生化指标。 三）流式细胞仪的工作原理 参数测量原理：流式细胞仪可以同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号和非荧光散射信号。 样品分选原理：流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的。 数据处理原理：FCM的数据显示方式包括单参数直方图（histogram)，二维点图（dotplot），二维高等图（contour），假三维图（pseudo 3D）和列表模式（list mode）等。 四，T细胞亚群的检测 1，实验内容：流式细胞术检测CD4+，CD8+T细胞。 2，实验原理（1）：T淋巴细胞具有高度的异质性，根据 其表面的标志和功能特征，可分为若干个亚群，各亚群之间相互调节，共同发挥其免疫学功能。因此，对淋巴细胞亚群数量的检测能反映机体的免疫功能状态。本次实验用流式细胞术检测CD4+,CD8+T细胞。（流式细胞术原理见前面流式细胞术的基本原理及应用） 实验原理（2） T淋巴细胞表面的CD分子与相应荧光素直接标记的抗人CD分子McAb结合后，细胞表面形成带有荧光色素的抗原抗体复合物。经激光激发后发出与荧光素相对应的特定波长的荧光，其荧光强度与被测CD分子表达密度成正比例关系，由此通过流式细胞仪课检测结合含有相应荧光素标记抗体的阳性细胞百分率。 3实验材料： （1）,肝素抗凝人全血 （2）,荧光标记单克隆抗体：抗人CD4-FITC,抗人CD8-PE(美国BD公司产 品） （3）,细胞洗液（含1%FCS的PBS) （4）,红细胞裂解液 （5）,细胞固定液 （25%戊二醛3.2ml， 葡萄糖2