第3章_核酸扩增技术(上).pptVIP

* PCR融合的缺失诱变（Deletion Mutagenesis by PCR Fusion） ??????? 使用两套引物分别扩增欲缺失片段两侧的序列（此两套引物的5-端序列互补）；利用两套扩增产物5-端的互补序列进行退火重叠并进行第二轮PCR延伸，获得完整的突变体（图14）。 * 新红外线蛋白质的结构，红色小图是活体小鼠发出的红外线 Roger Tsien钱永健 在美国出生，是中国科学家钱学森（中国航天事业的奠基人，“中国航天之父”、“中国导弹之父”、“火箭之王” ）的侄儿。2008年钱永健因改造GFP和日本科学家下村修，美国科学家马丁?查尔非共同获得诺贝尔化学奖，GFP能在生物学中广泛应用要归功于钱永健，正是他不断改造GFP才使得科学家们有多种观测细胞内部活动的标记选择。 1995年钱永健完成单点突变（S65T）。这个突变显著提高了GFP的光谱性质，荧光强度和光稳定性也大大增强，产生了增强型GFP，也就是EGFP。 其他的突变还包括颜色突变，现在有蓝色荧光蛋白（EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1）、青色荧光蛋白（ECFP, Cerulean, CyPet）和黄色荧光蛋白（YFP, Citrine, Venus, Ypet）。 2010年 钱永健 成功合成了红外线荧光蛋白。 可穿透动物肌肉组织的光源激发荧光那就太好了。将其导入腺病毒载体，感染小鼠后，能在小鼠体内检测到荧光。 钱三强 钱三强 --核物理学家中国原子能事业的主要奠基人,被誉为“中国原子能科学之父”  * 优点：操作简便、流程短、省时 缺点：特异性差，假阳性率高（固定、包埋、制片等使 标本内DNA受损， DNA修复时，标记dNTP进入非靶 序列；引物与模板的错配） 扩增效率低 不适用于切片标本（切片比细胞标本DNA受损重） * 目前最常用 优点：扩增效率高、特异性强（杂交探针特异性结合靶序列，不与扩增 产物中的非靶序列结合） 可用于细胞制备和石蜡切片标本 缺点：操作复杂 * RAPD分析结果：应用OPA-03引物在36株淋球菌中扩增出15个分子量不 同(280～1900bp)的特异片段。每株菌的扩增指纹分别由3～9个片段构成，共产生18种RAPD 型。全部菌株中扩增出1　200bp片段。除1株外，35株亦有420bp片段。每株菌扩 增2管， RAPD指纹基本一致。性伴组每对菌株的RAPD指纹相同。福州9株Pro-型多重耐药菌株中有6种RAPD型(图2)。分型结果与PFGE不完全一致，如PFGE图谱相同的菌株RAPD指纹不同，或情况相反。重庆10株原型菌呈现4种RAPD型。6株多重耐药菌的RAPD型相同，与PFGE结果 一致。11株PPNG * 反应体系包括：逆转录酶AMV-RT(37度延伸，且模版可以是DNA)、核酸酶H（RNase H）、T7RNA聚合酶、dNTP、NTP、两种特殊的引物（A和B）和缓冲液。引物A 5′端带有T7RNA聚合酶结合位点，3′端碱基与靶RNA 3′ 端序列互补，引物B的碱基序列与cDNA 3′端序列互补 专门催化5→3方向的RNA形成过程。T7RNA聚合酶具有高度启动子专一性，且只会转录T7噬菌体中位于T7启动子下游的的DNA或DNA复制品。最适反应温度分别为37°C RNA se H（一种逆转录酶，可以消化mRNA）、产物琼脂糖电泳EB染色即可 * NASBA：NASBA技术检测禽流感病毒NASBA（nucleic acid sequencebased amplification）是一项以核酸为模板的快速等温扩增技术。这项技术特别适用于RNA分子的检测。自2002年首次在国际性刊物上发表了关于应用NASBA技术检测禽流感病毒的论文以来，迄今已成功开发出针对A型禽流胁《舅醒切停℉1-H15）（NASBA-AIV）和特异性针对H5亚型（NASBA-H5）、H7亚型（NASBA-H7）的禽流感病毒的NASBA/ECL检测试剂盒。已正式发表的实验数据显示，NASBA技术比目前商品化的免疫检测试剂盒敏感10~1000倍，比常规PCR方法也敏感许多，与现行的病毒培养的检测方法灵敏认嗟薄５牵《九嘌ǔＰ枰恢芤陨系氖奔洳拍艿玫浇峁鳱ASBA技术常规仅需要4~6小时就可以准确地得到结果，便于尽早采取防治措施，不仅如此，该技术操作简便，自动化水平高，可以减少人为造成的误差，而且还是一种高通量的方法，可以同时检测50个样本，非常适用于大规模样品的筛查。 * Logistics University of Chinese