第2章蛋白质测序、分离及提纯.pptVIP

2.6.2 蛋白质的胶体性质 蛋白质的沉淀 Pr从胶体溶液中析出 Ⅰ可逆沉淀： 温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷 Pr结构和性质没有变化 适当条件下可重新溶解 ——非变性沉淀 pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等 不可逆沉淀 强烈沉淀条件 破坏Pr胶体溶液稳定性 也破坏Pr结构和性质 沉淀不能再重新溶解 ——变性沉淀 如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐 和生物碱沉淀等 乙醛酸反应 在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，在两层之间就会出现紫色环，凡含有吲哚基的化合物都有这一反应。 坂口反应 精氨酸分子中含有脈基，能与次氯酸钠（或次溴酸钠）及ɑ-萘酚在氢氧化钠溶液中产生红色产物。此反应可以用来鉴定含有精氨酸的蛋白质。 米伦反应 米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合液，蛋白质溶液加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。酚类公化合物有此反应。 紫外吸收 蛋白质分子中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基，这些氨基酸的侧链基团具有紫外光吸收能力，最大吸收峰在在280nm 处，故通过对280nm 波长的紫外吸光度的测量可对蛋白质溶液进行定量分析。 2.7 蛋白质分离提纯及分析技术 2.7.1 蛋白质分子量及其确定方法 蛋白质相对分子量在6000～1 000 000之间。测定分子量的主要方法有化学组成法、渗透压法、超离心法（沉降分析法）、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 元素原子量(分子分子量 ) 最低相对分子量= 元素(分子)百分含量 肌红蛋白含铁量为0.335%，其最低分子量可 按下式算出： Fe原子量(55.8 ) 最低相对分子量= Fe元素百分含量 (0.335%) =16700 真实分子量是最低相对分子质量的n倍，这里n是每个蛋白质分子中铁原子的数目。因为肌红蛋白中，n＝l，所以其真实Mr就是16700。又如血红蛋白含铁也是0.335%，即最低Mr亦为16700，但根据其他方法测得的Mr是68000。可见每一分子血红蛋白含有四个铁原子，即n＝4，因此其真实Mr＝16700×4 = 66800。 有时蛋白质分子中某一氨基酸的含量特别少，应用同样的原理，由这一氨基酸含量的分析结果，也可以计算蛋白质的最低相对分子质量。 例如牛血清清蛋白含色氨酸0.58%，计算所得的最低相对分子质量是35200。用其他方法测得的Mr是69000，所以每分子牛血清清蛋白含有两个色氨酸残基。 （一）利用溶解度差别的分离方法 2. 蛋白质的盐溶和盐析 中性盐对蛋白质有明显的溶解度影响。在低 浓度时，中性盐增加蛋白质的溶解度，这种现象 称盐溶。盐溶主要由于蛋白质分子吸附某种盐类 离子后，带电表层使蛋白质彼此排斥，而蛋白质 分子与水分子之间的相互作用却加强。 盐析：在蛋白质溶液中大量加入中性盐使水 的活度降低，原来溶液中大部分自由水转变为盐 离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分 子之间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化 层。 3. 有机溶剂分级法 （二）根据分子大小不同的分离方法 1.过滤与膜分离 高速离心机的最大转速为（1～2.5）×104 r/min ，相对离心力达到 1×104～1×105 g ，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。 超速离心机的最大转速达 (2.5～12)×104 r/min，相对离心力可以高达 5×105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。 3. 凝胶过滤层析（gel-filtration chromatography） （三）根据电荷不同进行分离 1.电泳 1） 区带电泳 是由于在支持物上电泳时各组分因迁移速度 不同分布成区带而的名。区带电泳按其支持介 质的物理性质不同可以分为四类： （1）纸电泳和聚酰胺薄膜电泳； （2）粉末电泳，支持介质是淀粉、纤维素粉或硅胶粉与适当的溶剂调和而成，铺设成平板； （3）细丝电泳，如尼龙丝和其他人造丝； （4）凝胶电泳，最常用的支持介质是聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)是由单体丙烯酰胺(