从热不稳定到光不稳定1.pptVIP

在之前的实验中，我们可以看到…… * 而在温度转换实验中，我们还发现了一个意外的结果。将42度培养的稳定期细菌转移到25度培养，按推测新合成的光修复酶可以保持活性，因此光修复活性应该缓慢恢复。但我们发现温度转换后很长时间，光修复酶的活性和蛋白水平都没有显著的变化。 * 这说明……。这里我们作了一个动画，这是一个含有ybgA和phr基因的多顺反子mRNA，两个编码区都可以作为翻译相应的蛋白质。我们推测YbgA蛋白可能可以结合到mRNA上，关闭了phr基因的翻译，因此即使之前翻译的光修复酶降解后，新的翻译也不能进行。这个推测还有待实验验证。 * * 在第二部分我们对CPF蛋白家族的系统发生作了分析。我们…… * 我们得到的分析结果和现有报道的结果类似。但我们在分析中发现了CPF家族的两个新的分支，即GIHY蛋白和SPL/MPL蛋白，这是我们的一个新的发现。 * 下面简单介绍一下GIHY蛋白。GIHY蛋白主要在存在真细菌中，在少数古菌和真核藻类也有发现。我们之所以将其称为GIHY蛋白，是由于其FAD辅酶的结合位点存在GIHY或W或F的特征序列。其在FAD辅酶N5位对面的残基大部分由天冬酰胺变为组氨酸，而异咯嗪环的嘧啶环上方的残基大多为异亮氨酸，在异咯嗪环二甲苯环上方的残基大多变为谷氨酰胺。此外GIHY的底物结合位点也发生了明显的变化。 * 因此我们推测GIHY蛋白应该具有一些新的性质，其应该没有修复紫外损伤的能力，而可能具有对未知底物的催化活性。此外，我们对GIHY的序列分析表明，大部分GIHY蛋白还具有C端延伸序列。综合以上几点，我们推测……。 * SPL/MPL蛋白是我们发现的另一个新的分支。SPL/MPL蛋白的特点在于其序列较短，一般在200-400个氨基酸残基左右。而一般CPF家族的蛋白长度都在400以上。和大肠杆菌光修复酶相比，SPL/MPL蛋白与辅酶和底物结合的位点高度保守，因此其可能具有修复酶CPD损伤的能力。但和大肠杆菌光修复酶相比，SPL/MPL蛋白缺乏N端的同源区，因此可能不能结合天线色素。此外，通过序列分析，我们推测有部分SPL/MPL蛋白可能含有铁硫中心。这些位置存在四个半胱氨酸，位置和间隔和之前提到的FeSBCP蛋白中形成铁硫中心的半胱氨酸很类似。 * 我们选取了玫瑰弯菌的SPL序列，使用SWISSMODEL对其进行了同源建模。结果我们可以发现，可含有铁硫中心的农杆菌的FeSBCP蛋白相比，玫瑰弯菌的SPL中也存在互相接近的4个半胱氨酸，且位置和FeSBCP蛋白的铁硫中心高度重合，很有可能也是能形成铁硫中心的。 * 综合以上几点，我们认为SPL/MPL可能也是一种比较古老的蛋白，也可能是所有CPF蛋白的祖先。 * 如果我们将CPF家族系统发生树的根放在SPL/MPL上，得到的树的结构也是合理的，说明SPL/MPL有可能是CPF家族的祖先，在进化中进化成CPF家族中其他的类型。 * 第三部分我们研究了E. coli光修复酶A377位突变对其光照稳定性的影响。下图左边是FAD辅酶的结构，其主要的功能基团是异咯嗪环，异咯嗪环可以分为三个环，分别是二甲苯环、吡嗪环和嘧啶环。如图所示的异咯嗪环朝向外的面叫做si面，朝内的面较re面。右边是大肠杆菌光修复酶FAD辅酶异咯嗪环附近的残基，其中A377位残基位于异咯嗪环si面嘧啶环的上方，而G381位位于二甲苯环的上方。N378位位于N5位的对面。 * 我们根据对CPF家族的系统发生分析，统计了在A377位同源位点的氨基酸分布。结果我们发现A377位在光修复酶和隐色素中的分布有明显的差异，在可能以CPD为底物的蛋白中，出现A、S、N的比例较高，而在6-4光修复酶和动物隐色素中，出现I、L、V的比例较高。其中有些6-4光修复酶在文献中报道在光照时会出现光致氧化。而动物隐色素中的果蝇隐色素是光照不稳定的。在植物隐色素中有些特殊，有一大半出现的是S，而一小半出现的是C。之前提到的拟南芥Cry1和Cry2，在A377位点一个是S，另一个是C，而Cry1是光照稳定的，而Cry2是光照不稳定的。 * 这幅图也是A377位同源位点的残基分布，A是可能以CPD为底物的光修复酶，B是可能以6-4光产物为底物的光修复酶。C是植物隐色素，D是动物隐色素和GIHY蛋白。根据A377位在光修复酶和隐色素中的分布规律，我们构建了大肠杆菌光修复酶A377位突变为S、N、V、I、L、C等的突变，表达纯化了突变蛋白，并对突变蛋白的性质作了检测。 * 首先我们研究了突变蛋白的光谱性质。图A是新鲜纯化的突变蛋白的吸收光谱，我们可以看到 * 4. Ming-Ming Jin, Peng Wang, Xue Li, Xiao-Yu Zhao, Lei Xu, Ping Song, Guo-Ping Zhu*. B