蛋白技术说课.ppt

SDS 阴离子去污剂 变性剂 氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。 蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异。 与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 SDS电泳 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，膜在正极一侧，接通电源以后，蛋白质由负极向正极转移至膜上。 （三）转膜 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 基本实验技术—Western blot 1. 固相支持物的选择 硝酸纤维素膜（nitrocellulose, NC) NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的 活性影响小； 非特异性本底显色浅； 价格低廉，使用方便。 结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失； NC韧性较差，易损坏。 Polyvinylidene fluoride (PVDF) 与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡（30s左右）,以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 基本实验技术—Western blot 2. 转膜方法的分类 （1）半干转法 －|纸|胶|膜|纸|＋ （2）湿转法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中。 －|海绵|纸|胶|膜|纸|海绵|＋ 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 基本实验技术—Western blot 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 转膜仪 3.实验步骤 Step1 准备6张适当大小的滤纸和1张适当大小的PVDF膜。 Step2 在转膜仪上垫上平衡过的3张滤纸（转膜液润湿）。 Step3 将分离胶盖于滤纸上，调整使其与滤纸对齐，将膜盖于胶上。 Step4 在膜上盖3张滤纸并除去气泡，并用转膜液润湿。 Step5 盖上转膜仪的盖子，接通电源开始转移。 半干法 电转10－30min 湿法 25KD 20-30min 、 25-70KD 45-60min、 70KD 1h 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 基本实验技术—Western blot 转膜注意事项 滤纸、胶、膜之间不能有气泡。 滤纸、胶、膜之间的顺序和大小，最好是膜=胶=滤纸。 PVDF膜需要100%甲醇预处理，后续操作中膜必须保持湿润。 胶和膜上要做好标记，识别正反面和上下 。 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 封闭条件：室温或者 37℃缓慢摇荡2～4h，特殊情况也可 4℃过夜。 （四）封闭 一抗或/和二抗与膜的非特异性结合会产生高背景，需要进行膜的封闭，常用的封闭液： 脱脂奶粉（5％） BSA（5％） Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供） 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 基本实验技术—Western blot Substrate Protein Protein Blocking Agent Blocking Agent Blocking Agent Membrane Primary Antibody Secondary Antibody/Enzyme (E) E E s s s s s s s s s Product P P P P P 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 （五）一抗、二抗孵育 把膜放在密闭塑料袋或小盒中，加入一抗溶液进行孵育，室温1h或4 ℃过夜。 回收一抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次5-10min。 加入用封闭液配制的二抗，室温孵育1小时。 回收二抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次5-10min。 扫膜或显影 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 基本实验技术—Western blot 影响抗原抗体反应的因素 电解质电解质可促进抗原抗体复合物的形成，因此常选用各种缓冲液做为抗体的稀释液。 酸碱度抗原抗体反应需要适宜的pH值环境，一般为pH6.0~8.0。 温 度在一定范围内，温度升高可使反应加速，但温度高于56℃时，可导致抗原抗体的解离，甚至变性。 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 （六）二抗与底物反应显色 1.显色方法 化学发光显色法(ECL ) 化学发光法(ECL) ECL显色原理：二抗用HRP标记，反应物为过氧化物+鲁米诺，如果遇到HRP即发光，可使胶片曝光显影。 辣根过氧化物酶法 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 基本实验技术—Western blot 2. 操作步骤 （1） 将A和B两种试剂在保鲜膜上