蛋白质化学结构与功能及研究方法更新说课.ppt

什么是转基因动物 将克隆的外源基因注射到一个受精卵的细胞核中，接种后的受精卵移植到雌性受体的子宫，使其顺利完成胚胎发育，移植后的受精卵发育生长为后代，其中的部分后代细胞中都携带有转入的外源基因，利用这些能产生外源蛋白的动物作为种畜或种禽，培育新的纯合系-转基因动物。 将特定的目的基因从某一生物体分离出来，进行扩增和加工，再导入另一动物的早期胚胎细胞中，使其整合到宿主动物的染色体上，在动物的发育过程中表达，并通过生殖细胞传给后代。这种在基因组中稳定整合有人工导入外源基因的动物-转基因动物。 转基因动物的制备程序 外源目的基因的制备 外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞 选择获得携有目的基因的细胞 选择合适的体外培养系统和宿主动物 转基因细胞胚胎发育及鉴定 筛选所得的转基因动物品系 转基因鼠的制备-微注射法 1980年，Gordon等人首先报道利用显微注射纯化DNA的方法获得了世界上第一只转基因鼠。 1982年，美国科学家使用显微注射技术将外源的大鼠生长激素基因导入小鼠的生殖细胞，发育成的转基因小鼠比对照鼠要大上2倍，被称为“超级鼠” 1983年先后获得了转基因猪、羊、鸡、兔、牛等。 人和鼠有百分之九十九的基因相同 1987年，首次报告从转基因鼠的乳汁中可获得有活性的人组织纤溶酶原激活剂和羊β乳球蛋白以来，通过转基因动物的乳汁获得异源性蛋白成为人们考虑生产治疗性蛋白的潜在体系。 1987年，Thomas等基因定点点突变转基因鼠诞生。 1988年，USPTO批准了专利历史上第一件哺乳动物专利—哈佛鼠专利，这是一只利用遗传工程方法改变了特征的转基因鼠。 1989年，卡佩奇发表了里程碑式的论文，第一只基因敲除小鼠 1989年，精子介导的基因转移方法制备转基因鼠和转基因猪。 1991-1992，绵阳及牛乳腺生物反应器。 1995年，美国学者secheler建立转基因鼠动物模型。 1997年，Wilmsut等克隆绵羊（Dolly) 1999年，基因打靶（敲除）(gene knockout) 2000年，转基因猴（安迪）诞生。 2007年，Mario Capecchi (USA，70岁）、Oliver Smithies（USA，82岁）和Martin Evans（UK，66岁）获诺奖。 转基因动物的应用 基因表达与调控的研究 人类疾病及遗传病的转基因动物模型研究 动物品种改良 利用转基因动物作为生物反应器生产目的蛋白 生产可供人体移植用的器官 噬菌体展示（Phage Display） 1985 年Smith首次证实丝状噬菌体fd 基因组能通过基因工程的手段进行改造，将EcoR Ⅰ内切酶的部分基因片段(171 bp 和132 bp)与p Ⅲ基因融合，获得的重组噬菌体可在体外稳定增生，表达产物能被抗EcoR Ⅰ内切酶抗体所识别。1988 年Parmley 等将已知抗原决定族与p Ⅲ的N端融合呈现在表面，可特异性地被抗体选择出来，并提出通过构建随机肽库可以了解抗体识别的抗原决定簇表位的设想。1990 年McCafferty也报道了用噬菌体展示技术筛选溶菌酶的单链抗体的方法，从而开始了这项技术的广泛应用的新时代。 三个基本因素 在噬菌体pⅢ和pⅧ衣壳蛋白N端插入外源待筛基因编码的蛋白基因，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面；同时其保持的外源蛋白天然构象能被相应的抗体或受体识别。 利用固相支持物上的抗体或受体，采用亲和筛选法（panning），从噬菌体文库中筛选出能结合筛选分子的目的噬菌体。 外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，其编码基因可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序推导出来。 Phage Display的原理 T7，M13等 表面等离子共振技术(Surface?Plasmon?Resonance?Technology,?SPR) 20世纪90年代发展起来的一种生物分子检测技术，是基于SPR检测生物传感芯片上配位体与分析物作用的一种前沿技术。SPR技术可以在天然状态下反映蛋白质/蛋白质、蛋白质/核酸、新药分子/疾病靶蛋白等生物分子互作，如特异结合/解离、分子识别等动力学过程，为实时/动态获取生物分子互作信息，从而阐明生命现象的分子机理提供了有效的研究工具，有助于更加全面和深刻地理解生物分子的结构和功能。 表面等离子共振（SPR）是一种物理光学现象。当入射光以临界角入射到两种不同透明介质界面（如镀在玻璃表面的金属银或金的薄膜）时，可引起金属自由电子的共振，电子吸收光能量从而使反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的入射光角度称为共振角（SPR角），SPR角随金属表面的折射率变化而变化，而折射率的变化又和结合在金属表面的生物分子质量成正比。因而可通过对生物反应过程中SPR角的动态变化获取生物分子相