目的基因的获得.讲述.ppt

cDNA 第二链合成的方法有四种：自身引导合成法，置换合成法，引导合成法和引物－衔接头合成法。 提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。 ① 原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。 mRNA只占总RNA的1%-2%。 ② mRNA的分离纯化：分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。 因此，很多公司都生产改造过的鼠反转录酶，它们缺乏RNA酶活性，因此更有利于生产全长的cDNA。 剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA，再用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。 对cDNA的克隆最初的报告发表于1970年代初期都是以同聚物加尾的方式为基础。 * * * * Creation of a genomic DNA library using the phage-λ vector EMBL3A. (1983年，采用一种酶对基因组进行切割。该克隆策略方便高效。) A convenient simpli?cation can be achieved by using a single restriction endonuclease that cuts frequently, such as Sau3AI. Sau3AI and BamHI create the same cohesive ends. 除了λ噬菌体衍生载体之外，还有其他许多的高容量克隆载体（如BAC、PAC、YAC等）都可以用于基因组文库的构建。这些载体的优点是平均插入片段的大小远大于λ置换载体，但文库较难制备，插入片段较大，不容易直接操作。 * * * 3 构建cDNA文库筛选目的基因 mRNA cDNA 反/逆转录 DNA 转录 A cDNA library is prepared by reverse-transcribing a population of mRNAs and then screened for particular clones. cDNA library：某种生物基因组转录的的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA分别与克隆载体重组，贮存在一个受体菌的群体中，这个群体就称为cDNA文库。 * Character of cDNA library（cDNA文库的特点） 分离的目的基因可直接用于表达 比DNA文库小的多，容易构建，文库的筛选比较简单易行； 以mRNA为材料，反映的是该生物特定发育时期、特定组织(或器官)在某种环境条件下的基因表达情况，有一定的时效性； 只与编码序列有关，因此 不能反映内含子、启动子、终止子以及与核糖体识别等的序列的结构和功能特征 * * * * Process constructing a cDNA library（cDNA文库的构建流程） * * * * (i) isolate mRNA（提取总RNA并分离mRNA）; (ii)?rst-strand DNA synthesis on the mRNA template, carried out with a reverse transcriptase（用Oligo( dT)（或随机引物）作引物，以RNA为模板，逆转录酶合成cDNA的第一链）; (iii) removal of the RNA template（去除RNA/DNA杂合链中的RNA，碱处理或RNaseH处理）; (iV) second-strand DNA synthesis using the first DNA strand as a template, carried out with a DNA-dependent DNA polymerase, such as E. coli DNA polymerase I（以cDNA第一链为模板，用DNA依赖性的DNA聚合酶合成cDNA第二链）. 1：分离mRNA，通过反转录的方式合成cDNA * * * * 2：cDNA与载体连接，形成重组载体 在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。 （通过接头形成粘性末端而连接） 或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。（通过寡聚化形成粘性末端而连接） 3：噬菌体颗粒的包装及转染或质粒的转化（导入宿主中繁殖），得到cDNA文库 注：刚合成的cDNA双链的末端几乎不可能正好是内切酶的酶切位点，因此这里肯定不存在由粘性末端直接相连的例子。这一点与基因组DNA与载体的相连有所区别。 4：从cDNA文库中筛选目的重组子 * * * * * * How