20150423-酵母双杂--吴晓萌.pptVIP

酵母prey质粒提取，转化E.coli BsrGⅠ酶切检测 测序（确定阅读框准确性） Blast 确定互作蛋白 确定 cDNA insert （prey）的阅读框，及其与 GAL4 AD ORF 的连续性. 多个阳性克隆编码的是同一个蛋白，是一个很好的指标 经典验证 (但是费时): 交换诱饵和猎物重新检测 用其他系统验证互作，如co-immunoprecipitation. 1、融合体蛋白之间的相互作用是在真核酵母细胞内进行，蛋白质有可能保持天然的折叠状态，它所证实的蛋白质间相互作用将更接近于在体的真实水平。 2、双杂交系统的敏感度极高，许多微弱或短暂的蛋白质之间的相互作用可以借助报道基因表达过程中的多级放大效应反映出来； 融合蛋白基因在强启动子的作用下，处于较高的表达水平。 3、在筛选 cDNA 文库时，双杂交系统能够简捷地得到编码相互作用蛋白的基因序列， 它只需构建质粒而不必准备抗体或纯化蛋白，省略了其它体外检测蛋白之间相互作用方法所必须的蛋白抽提、纯化等繁琐步骤。 1、假阳性较多：在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下，报告基因仍被激活。 原因： （1）BD融合诱饵蛋白的单独激活作用。 （2）AD融合靶蛋白与BD相互作用或者AD与BD融合蛋白之间的相互作用，尤其是后者带来许多假阳性。 措施： （1）作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。 （2）采用多个报告基因，且每个报告基因的上游调控区各不相同。 （3）报告基因整合到染色体上，可使基因表达水平稳定。 （4）优化3-AT(3-aminotriazole)浓度。适当增加浓度可减少假阳性。 2、阴性干扰：两个蛋白本应发生相互作用，但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来。 原因： （1）融合蛋白的表达对细胞有毒性。 （2）蛋白间的相互作用较弱。 （3）蛋白在酵母中不能稳定地表达，或者不能正确地折叠，或杂交蛋白不能转入细胞核。 措施： （1）选择敏感性较低的菌株或拷贝数低的载体 （2）应选择高敏感的菌株或多拷贝载体。 1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质与蛋白质的新功能 2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 3、筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响　 4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图 （Genome Protein Linkage Map） * * 主讲人：吴晓萌 亓守美 卢凡 蛋白互作--why研究方法 讲述分工 蛋白质经常以大型、多亚基的复合物起作用 --核糖体、酶 我们可以通过了解一个蛋白与其他蛋白的相互联系来推测该蛋白的功能。 遗传学方法 --酵母双杂（Yeast two-hybrid system） 生化方法 --免疫共沉淀（Co-ip） --Tag pull down --亲和纯化-质谱（AP-MS） 细胞学方法 --双分子荧光互补实验（BiFC） --荧光共振能量转移（FRET） 酵母双杂系统 概述 基本原理 实验流程 优缺点及应用 酵母双杂交系统的建立，基于真核生物调控转录起始需要有转录激活因子的参与。 真核转录激活因子在结构上是组件式的，即这些因子往往由两个（或以上）相互独立的结构域构成： -- DNA结合结构域（DNA binding domain，BD） -- 转录激活结构域（activation domain，AD）。 这两个结构域分开时仍分别具有功能，但不能激活转录。 在酵母双杂交系统中，“诱饵”蛋白X克隆至DNA-BD载体中，表达DNA-BD/X融合蛋白；待测试蛋白Y克隆至AD载体中，表达AD/Y融合蛋白。二者共转化酵母菌株，若X与Y蛋白有相互作用，则DNA-BD和AD也随之被牵拉靠近，恢复行使功能，激活酵母下游报告基因表达。 Expression of reporter gene DBD Promotor Reporter gene AD GAL4 UAS 酵母GAL4转录因子 DNA结合结构域(DBD) (DNA binding domain) 转录激活结构域(AD) (activation domain) BD BD GAL 4 UAS Promoter AD AD AD AD AD AD Expression of reporter gene AD A bait (fused to BD) A library of cDNAs fused to AD A prey interac