免疫学实验教学课件.ppt

实验四 间接ELISA实验 原理 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA) 。 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。同时抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。 在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 实验材料 1.抗原 流感病毒血凝素蛋白(HA) 2.兔抗HA血清 3.ELISA板、封闭液、洗涤液、TMB底物、终止液、酶标仪等。 实验步骤： 1.抗原的包被：1ug/孔 抗原（HA）包被24小时。 2. 封闭：每孔100ul封闭液，37度封闭30min，然后洗涤3-5次，每次至少3min。 3.一抗反应：设定两孔加入PBS作为空白对照，每孔加入稀释好的一抗（1：400开始倍比稀释6孔）100ul，37度反应1小时以上，然后洗涤3-5次，每次至少3min。 4.二抗反应：每孔加入稀释好的二抗（1：10000）100ul， 37度反应0.5-1小时，然后洗涤3-5次，每次至少3min。 5. 底物显色： 每孔加入配制好的底物液50ul，37度避光反应10-15min。 6. 显色终止及读数： 上述显色的孔内加入50ul终止液，上酶标仪读数。酶标仪读数波长是450纳米。 实验结果 根据抗体的稀释度，确定抗体的效价。 免疫学实验 授课老师：王晓杜 实 验 须 知 实验课的目的要求 免疫学实验课的目的是加强和巩固对课堂讲授的基本理论的理解和体 会，学习和掌握免疫学实验的基本操作技术。为今后的实际工作和科研 工作打下基础。为上好免疫学实验课，要求同学做到如下各点： 课前务必做好充分预习，明确实验目的、原理、方法及操作中的注意 事项，做到心中有数。 在实验进程中，严格按照实验指导所列步骤和要求进行操作，坚持实 验的严肃性、严格性、严密性。 真实记录实验结果，对错误的结果要认真分析，找出原因，得出结论。 实验完成后，写出实验报告及时交给老师批改。 严格遵守实验室规则，防止各种事故发生。 实验室规则 1.免疫学实验材料，有些是病原微生物，在实验中稍一不慎和防护上的不善，便有发生人身感染的可能。所以要求同学认真遵守下列各点： 2. 进入实验室先把个人书包放到指定地点，实验台上只放实验指导、记录本和文具。 3. 实验室内必须肃静、整洁，不得高声谈笑和随便走动。 4. 禁止吸烟、饮食，不能用手抚摩头面，以防感染。 5. 实验中如发生割破皮肤及实验材料破损事故，应立即报告教师，进行紧急处理。皮肤破伤可用2%红汞或2%碘酒消毒。污染桌面、地面和物品可用3%来苏儿来消毒。 6. 用过的有菌器材和培养物放于指定地点，经过菌液的吸管放在装有消毒液的桶内，用过的载片，用后立即放到消毒缸内，不得弃置桌上。 7. 注意节约实验药品，爱护实验器材，如有损失和破损，立即报告教师，等候处理。 8. 易燃物品（酒精、二甲苯等）不准接近火源，如遇火险，先关掉电源，再用湿布和沙土覆盖灭火。 9. 实验结束。将实验台收拾整齐，擦净桌面，再洗手消毒后离去。 10. 值日生扫好室内卫生，并检查水、电等开关是否关好，防止发生安全事故。 实验一 与免疫相关的细胞形态的观察 目的要求： 观察与免疫相关的几种细胞的形态，了解它们在机体免疫反应中的作用。 血涂片的制作方法 （1）沾一滴血在干净载玻片右端。 （2）另取一边缘光滑平齐的玻片作为推片，推片与载片约成20～30°，并与血滴接触，使血滴在玻片边缘散开，迅速将玻片推向左方。 （ 3）作成一均匀和厚度适中的血涂片。 （4）瑞特氏染色。将已干的血片滴上染色液，经染色3-5分钟，用水冲洗或吸干，待干燥后即可观察。 观察方法： 先在低倍镜下观测，找到血细胞分布比较均匀，有核细胞（白细胞）比较多 的区域，然后在油镜下观察。 红细胞： 淡红色，无核的圆形细胞，因红血球为双凹形，