荧光定量PCR技术原理及应用材料.ppt

荧光定量PCR技术原理及应用 REAL-TIME PCR PCR产物的积累是按照2n指数扩增。PCR后借助电泳对扩增反应的终产物进行定量及定性分析。 RT-PCR What is Real-Time PCR? What is Real-Time PCR? What is Real-Time PCR? 所谓实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量和定性分析。 在实时荧光定量PCR反应中，引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，产物不断积累，荧光信号强度也等比增加。通过检测荧光强度的变化，我们就可以得到荧光扩增曲线。 如何对起始模板定量? 通过CT值和标准曲线实现对起始模板的定量分析。 为什么要用CT值定量？ 在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该CT值具有极好的重复性。 绝对定量 用于生成标准曲线的样品如何设定？ 含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 含有和待测样品相同扩增片段的cDNA 紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度 根据质粒或cDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀释 双标准曲线法 （1）不同基因扩增效率存在差异，用标准曲线来校正扩增效率。 （2）比较适合于样本量不大，但研究的基因较多的客户。 （3）双