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* 第八章 基因克隆和分离策略 克隆基因的途径概括起来分为两种 传统遗传学或正向遗传学途径： 　以欲克隆基因所表现的功能为基础，通过鉴定其产物或某种表型突变分离基因 反向遗传学途径： 　着眼于基因本身，通过其特定的序列或其在基因组中的特定位置进行 现有基因克隆方法可以归纳为以下5大类： 以已知序列为基础的基因克隆方法 以分子标记连锁图谱为基础的基因克隆方法 以人工突变体为基础的基因克隆方法 以表达差异为基础的基因克隆方法 利用生物信息学手段的基因克隆方法 一、以已知序列为基础的基因克隆方法 以已知序列为基础的基因克隆方法，根据序列的不同又可分为： 以氨基酸序列为基础 以核苷酸序列为基础的两种不同的研究方法 1、以氨基酸序列为基础的基因克隆方法 以氨基酸序列为起点是分子生物学进行基因克隆最经典的方法。 通过对表达的或者差异表达的蛋白质分子的序列进行测定分析以后，获得该蛋白质的一段氨基酸的序列。 根据编码不同氨基酸的密码子设计出一条简并引物，利用这条RT-PCR或者进行RACE-PCR扩增的方法克隆基因的全长。 在自然界的进化过程中，蛋白质编码的氨基酸存在着保守区段，这些保守区段在不同生物的种、属之间，甚至在不同门类的生物体之间存在着高度的同源性。 如果在某一种生物体中该基因已经被克隆，可以利用这些保守区端的核苷酸为探针筛选cDNA文库。 或者利用这个引物与基因的5’和3’端的特殊引物配对进行RACE-PCR扩增的方法克隆基因的全长。 2、RACE-PCR与同源序列法扩增全长基因 由于PCR扩增的错误性和基因存在着不同的基因家族的可能性，这个拼接以后的全长基因还必须进行分析验证，即按照理论上的全长基因分别设计出可以扩增全长基因的一对引物，利用这对引物扩增基因的全长片段，将该片段进行克隆测序后就可以得到待克隆基因的全长cDNA序列。 利用同源序列为基础进行基因的克隆是基因克隆手段的一个重要方面，特别是多个不同的模式植物的基因组完成测序以后，根据不同生物的基因进化的特点和保守性，利用微生物或者人类基因组中已经克隆基因的保守区段在植物上进行同源基因的克隆是十分有效的；或者在同一个科或者属的不同植物之间由于基因在染色体上存在着同线性和共线性的特点，使得同源基因的方法更加快速。 二、以分子标记连锁图谱为基础的基因克隆方法 以分子标记连锁图谱为基础的基因克隆方法是分子标记发展的一个重要成果。 分子标记连锁图谱为基础的基因克隆又称为图位克隆或者基因定位克隆方法。 图位克隆方法的主要方法的主要原理是根据基因在图谱上的相对位置来进行基因克隆的一种方法。 首先是通过遗传分析将目的基因定位在染色体的一定区间内，或者说在目的基因的两侧获得若干个连锁的分子标记。 其次是构建含有较大基因组片段插入的文库如BAC文库或者YAC文库以及Cosmid文库等。 最后通过功能互补分析、基因功能的缺失或者基因的移位等方法来分析基因的功能。 构建高密度的RFLP、RAPD或者SSR等分子标记的连锁图谱是进行基因克隆的关键。 通过图谱的构建将目的基因定位在一个很小的区间内（通常要求在2cM的区段）是进行图位克隆的一个必要条件之一，分子标记与目的基因的快慢。 最后通过功能互补分析、基因功能的缺失或者基因的移位等方法来分析基因的功能。 分子标记构建的要求 染色体步移 利用分子标记分离到与分子标记同源的插入克隆，然后通过重叠群的分析获得候选基因克隆的一种方法。 染色体步移的方法通常以大片段的插入文库为步移的起始文库，选用这种文库可以大幅度地减少染色体步移的工作量。如果选用插入片段较小的基因组文库作为染色体补移的起始文库，由于高等植物基因组中大量的重复序列的存在使染色体步移工作变得十分的艰难。 标记1 标记2 转基因功能验证 从原理上讲，染色体步移的过程是一个比较简单的过程，并且在理论上可以分离任何一个基因。但是在实际的工作过程中，由于每一个步骤都要求相对精确，并且实际过程非常烦琐，而且比较费时和费力，因此在实际的运用上基因组比较小的植物可以采用，而对基因组比较大的植物就显得非常困难。 三、以人工突变体为基础的基因克隆方法 突变体是遗传分析的基础，无论是经典的遗传学还是现代遗传学，对于突变分析是遗传学永恒的主题。 理论上讲，任何一个野生型都有突变型，一个野生型都可能找到他的突变型个体。但是由于生物体的进化特点或者条件的限制等因素，要在自然界中找到具有一个特定形状的突变体十分的困难。 因此，为了基因的研究方便和对基因组中所有的基因进行研究，采用人工方法创造出突变体对于开展基因的克隆以及基因的功能分析十分重要同时也十分方便 1、转座子标签法 “植物转座子”概念是在1948年由美国的科学家Barbana Mclintock在玉米中首先提出