MTT法原理步骤.docVIP

细胞的增殖检测（MTT法MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。 检测原理3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐（商品名：噻唑蓝），是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中60℃水浴助溶，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4 避光保存即可在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。PBS配方：Nal 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，调pH 7.4 定容1LMTT法实验步骤普通MTT法实验步骤 终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。 每孔加150ul DMSO，脱色摇床振荡10min，使结晶物充分融解。 4、比色：选择490nm（570nm）波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 （二）药物MTT法实验步骤贴壁细胞 1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μl,铺板使待测细胞调密度至103-104/孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。 2）5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）加入浓度梯度的药物原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药一般5-7个梯度每孔100μl设3-5个复孔建议设5个，否则难以反应真实情况3）5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。 4）每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。 5）终止培养，小心吸去孔内培养液。 6）每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。 7）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜） 悬浮细胞 1）收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序补足的1640（无血清）培养基40μl ；加Actinomycin D（有毒性）10μl用培养液稀释 (储存液100 g/ml，需预试寻找最佳，1:10-1:20)；需检测物10μl；细胞悬液50μl（即5×104cell孔），共100μl加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100 1640）。 2）置37，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。 3）每孔加入10 μl MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值） 4）离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。 5）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔注意事项MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内MTT一般最好现用现配，过滤后4避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。 3、MTT有致癌性，用的时候小心有条