1.2基因工程的基本操作程序(上课)分析.pptVIP

复习:基因工程的基本操作步骤 提取目的基因， 目的基因与运载体结合， 将目的基因导入受体细胞， 目的基因的表达和检测 看课本P8的图 一、目的基因的获取 2、获取方法： （1）、从基因文库中获取目的基因。 （2）、人工合成 （3）、 利用PCR技术扩增目的基因 3.从基因文库中获取目的基因 ①、什么叫基因文库？ 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 基因组文库的构建模式图 利用PCR技术扩增目的基因 PCR:聚合酶链式反应：是以DNA变性、复制的某些特性为原理设计的 前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物。 启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录 显微注射技术 * 1.2 基因工程的基本操作程序 1、目的基因：主要指的是编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。 基因文库 基因组文库 部分基因文库 （cDNA文库） 通过对 受体菌 的培养而储存基因 反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因，再与载体连接后储存在一个受体菌群中。 目的基因的mRNA 单链DNA 反转录酶 cDNA文库的构建方法 DNA聚合酶 双链DNA (目的基因) 基因组文库与部分基因文库的关系 补：原核细胞的基因结构 非编码区 非编码区 编码区 与RNA聚合酶结合位点 启动子 终止子 RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。 转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。 转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。 补：真核细胞的基因结构 编码区 非编码区 非编码区 与RNA聚合酶 结合位点 内含子 外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子 启动子 终止子 内含子： 外显子： 都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的 相同点 编码区是间隔的、_____的 编码区是 _____的 不同点 真核细胞 原核细胞 原核细胞与真核细胞的基因结构比较 思考 编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？ 连续 不连续 编码区 非编码 ②如何从基因文库中得到所需要的基因 依据：目的基因的有关信息。 如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性。 原理： DNA双链复制 反应过程： 1加热至90～95 ℃ 目的基因DNA解链 2冷却至55～60 ℃， 引物结合到互补DNA链 3加热至70～75 ℃， 热稳定DNA聚合酶从 从引物起始互补链的 合成 PCR技术与体内DNA复制的区别： 1. PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要； 2. PCR需要耐热的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性； 为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？ 构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。 但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。 2.基因表达载体的构建 调节基 因 操纵基 因 结构基 因 RNA聚合酶 半乳糖苷酶 酶 酶 RNA聚合酶 启动子 结构蛋白基因 RNA聚合酶 标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来 不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是： （1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因