用于基因克隆的载体预案.ppt

重要的噬菌粒载体：pUC118 / 119 pUC118 pUC18 + M13间隔区 IG pUC119 pUC19 + M13间隔区 IG 500 个拷贝 3200 bp MCS lacZ’ lacI ori Apr M13-MG pUC118 / 119 表示M13辅助噬菌体DNA 滚环复制 重要的噬菌粒载体：pBluescript （体外转录载体） pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT7 2958 bp MCS lacZ’ PT7 ori Apr f1-ori pBluescript PT3 噬菌体启动子PT3和PT7强化外 源基因的转录 提取出来的单链DNA重组分子 在噬菌体RNA聚合酶的存 在下，又可实现外源基因 的体外转录 四、人工染色体载体 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百 甚至上千 kb 的DNA片段， 此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载 量也远远不能满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳 定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外 源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成人工染色体， 它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 目前常用的人造染色体载体包括： 细菌人工染色体（BAC） 酵母人工染色体（YAC） 人工染色体 实际上是一种“穿梭”克隆载体：含有质粒克隆 载体所必备的第一受体（大肠杆菌）源质粒复制起始位点（ ori），还含有第二受体（如酵母菌）染色体DNA着丝点、端 粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。 酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosomes, YAC） YAC载体应含有下列元件： 酵母染色体的端粒序列：TEL pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 酵母染色体的复制子 ：ARS 酵母染色体的中心粒序列：CEN 酵母系统选择标记：URA3/TRP1 大肠杆菌的复制子 :ori 大肠杆菌的选择标记:Ap YAC载体的装载量为350 - 400 kb 酵母人工染色体的使用： pYAC4 CEN EcoRI URA TEL BamHI TEL ori Apr TRP ARS EcoRI EcoRI EcoRI BamHI 连接 转化酵母菌 重组酵母染色体 易于发生重组、缺乏稳定性、制备工艺繁琐 细菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC） 细菌人工染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上 构建的，其装载量范围在50 - 300 kb之间 各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝 pBACs主要适用于： 克隆大型基因簇（gene cluster）结构 构建动植物基因文库 细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC） 优点：能携带大片段DNA，约300kb 保留了与F 因子的自主复制、拷贝数控制以及质粒分配等基本功能相关的基因 用于基因克隆的载体 质粒载体 噬菌体或病毒载体 考斯质粒 人工染色体载体 几类载体的比较 噬菌粒 复制子：种类及其对应宿主 选择标记：种类及其对应宿主 容量（载量）： 用途： 思考题 1.基因工程载体必须满足哪些基本条件？ 2. 质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？ 3. 噬菌体载体有哪些？携带能力分别有多大？ 4. 什么是穿梭载体？ * * l 噬菌体的裂解途径——生活史 E.coli 吸附 LamB受体 注入 复制 包装 裂解 lamB受体：麦芽糖转运蛋白 l 噬菌体的裂解途径——l 噬菌体的体内包装 包装范围为原DNA的75 - 105%： 36 - 51 kb 体内包装 100个左右的拷贝 包装范围为原DNA的75 - 105% 即 36 - 51 kb D A 串连多聚体 先行θ复制，再经环滚式复制形成串联重复 滚环方式（rolling circle） D.S. DNA → Nick → leading Strand →Elongation → rolling l 噬菌体的溶原状态 l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶原状态 DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状