分子生物学复制资料.ppt

第三篇 基因信息的传递 第十章 复制的方式 ——半保留复制(semi-conservative replication) 双向复制(bidirectional replication) 半不连续复制(semi-discontinuous replication) 复制的高保真性(high fidelity) 一、半保留复制的实验依据和意义 DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。 半保留复制的证明——密度梯度实验 二、双向复制 1、原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。 2、真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。 从一个DNA复制起始点起始的DNA复制区域称为复制子(replicon) 。 复制子是独立完成复制的功能单位。 冈崎片段： (okazaki fragment) ? 1968年日本生化学者冈崎用电镜及放射自显影技术，观察到DNA复制中出现一些不连续的片段，将这些不连续的片段称为冈崎片段。 ? 原核生物: 1000~2000个核苷酸 ? 真核生物: 100~200个核苷酸 聚合反应机理 聚合反应的特点: ? 以单链DNA为模板 ? 以dNTP为原料 ? 引物提供3-OH ? 聚合方向为5 →3 ? 遵守碱基互补规律 二、DNA聚合酶 全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase) 简称：DNA-pol 核酸外切酶活性 （一）核酸外切酶活性和校读 　　核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的。 （二）复制的保真性和碱基选择 ? DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。 ? 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。 冈崎片断的连接 DNA-polⅢ同时合成领头链和随从链 细胞周期（Cell cycle） 指细胞分裂的时相变化。 体内活细胞周期长短相差悬殊，关键在G1进入S期。营养良好的培养细胞周期约24小时。 典型的细胞周期分为4期： G1期（DNA合成前期） S期（细胞分裂的合成期），合成DNA G2期（ G2期主要合成一些与有丝分裂中新细胞形成所必需的物质） M期（细胞染色体形成并发生细胞分裂，新细胞在此期形成） 一个细胞周期DNA只复制一次,而且是半保留复制. ? 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。 ? 复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)。 ? 增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。 　　增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）在复制起始和延长中起关键作用。PCNA为同源三聚体，具有与E.coli DNA 聚合酶Ⅲ的β亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合环形的可滑动DNA夹子，在RFC的作用下PCNA结合于引物－模板链；并且PCNA使polδ获得持续合成能力。PCNA水平也是检验细胞增殖的重要指标。 细胞能否分裂，决定于进入S 期及M期这两个关键点。G1→S 及G2→M的调节，与蛋白激酶活性 有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑 制各种复制因子而实施调控作用。相 关的激酶都有调节亚基即细胞周期蛋白 (cyclin)，和催化亚基即细胞周期蛋白依 赖激酶(cyclin dependent kinase，CDK)。 　　哺乳类动物细胞内还发现天然抑制CDK的蛋白质，例如锚蛋白(ankynin)是CDK4的特异性抑制物，P21蛋白能抑制多种CDK。锚蛋白和P21蛋白的抑制/活化可使细胞周期开放/关闭，因此被形容为细胞周期的检查点(check point)蛋白。 真核生物复制的特点： 1、不同染色体各自进行复制 2、复制速度：是原核的1/10，但复制起始点多,每个染色体有上千个复制子 3、引物