总RNA提取,cDNA文库构建和基因克隆说课.pptVIP

分级分离要注意的问题 尽可能只收集前三管，避免混入小片段，以免影响载体连接，造成重组效率低。 如果经检测有小片段没有驱除干净，要重复双链合成和分级分离的话，要注意: 不要让基质主体过干； 柱子室温储存备用； 不要有气泡； 双链混合物要混合均匀以免导致不能有效分离。 5、连接与转化 转化 同时做阴性对照和阳性对照实验检测感受态细胞； 结果：阴性对照无菌落生长；阳性对照长满了菌落； 实验组平板上的菌落形成汇片，这样的平板可包含几千个菌落。 连接 6、测定质粒文库滴度 计算菌落数来确定文库滴度 colonies on plate/ [plating volume(ml) x dilution factor] = cfu/ml 注意： 稀释后的文库会不够稳定，所以稀释之后要尽快在滴度降低之前进 行实验； 使用推荐的抗生素浓度的培养基，以确保质粒的稳定性； 通常情况下，用于长期保存的质粒文库滴度要达到108 cfu/ml 。 实验小结 保证获得数量足够的高质量的起始RNA。 反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键。 层析柱cDNA分级很关键。这一步稍不注意会影响获得的cDNA的片段分布特点。 质粒文库对载体与cDNA的连接效率要求很高，也对连接产物转化大肠杆菌的效率要求很高。 基因克隆(PCR) 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）：简称PCR，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程，是一项在短时间内大量扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。 PCR原理 变性：95 ℃ 退火：60℃ 延伸：72℃ PCR反应五要素 引物（primer） 酶（DNA polymerase） dNTP（dATP, dGTP, dCTP, dTTP） 模板（template） Mg2+（magnesium） 引物-PCR特异性反应的关键 引物长度15-30bp； G+C含量：40%-60%； Tm值与G+C含量有关，通过调整G+C含量使Tm值处于60-70℃； ATGC随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶成串排列； 引物3’末端的碱基要求严格配对，且最末端核苷酸避免用腺嘌呤A； 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补； 特异性引物/兼并引物 酶 根据实验目的选择合适的酶： 普通Taq酶 高保真酶 长片段酶等 一个典型的PCR反应约需酶量2.5U（总反应体积为100ul） 浓度过高引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少 模板 模板基因的完整性是PCR反应成功的关键； 模板纯度尽量高，避免脂类和蛋白质污染； 模板量要适中，浓度过高或过低均不利于PCR反应； RNA模板要防止降解，PCR过程中用专门试剂，且需加入RNA酶抑制剂。 Mg2+浓度 Mg2+对PCR反应的特异性和产量有显著影响； Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异性扩增。浓度过低会降低DNA聚合酶活性，使反应产物减少。 PCR反应条件的选择 温度 时间 循环次数 温度设置 变性：90-95 ℃，温度过高会影响DNA聚合酶的活性，温度过低则需延长时间使变性充分； 退火：根据引物的Tm值确定，一般退火温度=Tm-5℃; 延伸:70-75℃，一般选择72℃。 时间设置 变性：30-60s，根据变性温度和模板基因长度确定，普通PCR选择95℃变性30s即可； 退火:取决于引物的长度、碱基组成和浓度，一般选择30-60s； 延伸：取决于模板基因的长度，常规体系72 ℃ 60s可延伸1000bp左右。 循环次数 循环次数：取决于模板DNA的浓度； 循环次数多，DNA聚合酶的活力降低，非特异性扩增产物的量增多；循环次数少，扩增产物的量少； 一般选择30-40次之间。 PCR反应类型 普通PCR; 梯度PCR； 降落PCR； 半巢氏PCR; 巢氏PCR; RT-PCR; RACE-PCR； 荧光定量PCR等 PCR失败的常见原因及解决办法 模板质量差：目的基因断裂、含量低或残留试剂成分；解决办法：重新制备模板、增加循环次数或改用巢氏/半巢氏PCR； 引物质量差：引物设计错误、特异性差或纯度低；解决办法：重新设计/合成引物； DNA聚合酶失活：更换新酶； 污染：更换新的试剂、引物和模板； 反应体积过大：减小反应体积。 * 如果3个比例的连接均失败,那就要将剩余量都进行连接反应,但是连接前要电泳检测1ul,用已知量的对照做参照.应该在100-200 ng/ul之间.也可将1 ul量直接点在带EB的板子上.重组效率低,可排除载体自连,原因可能在于混合物中