微生物实验报告普通染色和格兰染色.docVIP

实验二 细菌的分离和革兰氏染色 实验目的 掌握细菌涂片标本的制备方法和普通染色的步骤； 掌握革兰氏染色法的步骤和关键点； 识别细菌的革兰氏染色结果； 学习无菌操作技术 。 实验原理 一般认为革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。 虽然如此，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果，因为酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。 实验器材 载玻片，盖玻片，接种环，酒精灯，显微镜、擦镜纸、镜油、擦镜液； 结晶紫、革氏碘染液、95%酒精、番红染液； 枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和未知菌的18小时的液体培养液，酵母菌 平板，大肠杆菌平板，牙垢。 实验步骤 涂片 左手持菌液EP管，右手持接种环，在火上对接种环灭菌后，从EP管中取一环培养液，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈），将接种环在火焰上烧灼灭菌。若是从平板上取材，则事先在载玻片上滴一小滴水，在火焰附近把平板打开一小口，用接种环调取菌落边缘的物质涂于水滴上。 室温下自然干燥。 固定 手持或镊子夹载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。 初染 滴加1滴草酸铵结晶紫染液，染色1分钟，水洗，吸干。 媒染 用碘液冲去残留水，再加1滴碘液覆盖涂片1分钟，水洗，吸干。 脱色 用吸水纸吸去玻片上的残留水，滴加95%的乙醇脱色，轻轻摇动玻片，倒掉脱色液，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，吸干。脱色时间20~30秒。 复染 滴加1滴蕃红染液复染1-3分钟以上，水洗。 显微镜观察 吸干载玻片背面及标本周围水渍，先用4*10的倍数找到合适的视野，再油镜观察。 实验结果 6张装片的实验结果见表1，照片见图1。 表1 . 各菌种的染色结果及形态特征 菌名 形态特征 染色结果 结论 枯草芽孢杆菌 个体较大，呈杆状，多见成对短链状 红色，G－ 假阴性 金黄色葡萄球菌 个体小，球状，成团存在 紫色，G＋ 符合理论 大肠杆菌 个体小，短棒状，分散存在 红色，G－ 符合理论 未知菌 个体小，球状，分散存在 紫色，G＋ 未知菌为G＋菌 酵母 个体巨大，卵状，成团存在 紫色，G＋ 符合理论 牙垢 个体小，球状，成团存在，杂质较多 紫色，G＋ 牙垢中基本上为G＋菌 （a）枯草芽孢杆菌，10×100倍放大 （b）金黄色葡萄球菌，10×100倍放大 （c）大肠杆菌，10×100倍放大 (d)未知菌，10×100倍放大 （e）酵母，10×100倍放大 （f）牙垢，10×100倍放大 图1. 微生物革兰氏染色显微照片 讨论 涂片时的干燥 在涂片时，如果是直接调菌液，则用接种环一蘸即可，如果是从平板菌落上取样，事先滴水时千万不要滴太大的液滴，总之是为了使涂片尽快干燥。如果不慎水加多了，不能用吸水纸吸，因为此时还没有固定，会将大部分细菌吸走。可考虑放到酒精灯上方较远处，微热干燥，以手心能感到温暖为宜。不能太低，会对细菌造成杀伤。 固定 本次实验中较难掌握度的一步。在火焰上方约10cm处来回过3～4次即可。固定不充分的话后续清洗时会将细菌洗掉，固定过热的话又将细菌烧焦，不能上色。需要注意的是，热固定会改变细菌的内部结构和外形，若研究菌体细胞结构时还是要用化学固定法。 脱色时间 最难掌握度的一步！脱色时，最初洗下的酒精都看不出初染的蓝色，也就无法判断脱色是否充分，所以只能通过多次实验，建立洗脱时间梯度来逐步摸索。我们的金黄色葡萄球菌做了3次才得到勉强理想的染色结果。个人觉得用不了书上说的30s，洗2次大约15s就足够了。 基础实验，我们可以根据已知的菌种知识来调节洗脱时间，比如G＋就洗短点，G－就洗长点，但是对于以后的未知菌种，这样做是不可以而且不可能的！所以一定要在基础试验中打下扎实的革兰氏染色操作基础，标准化动作，以后才能对未知菌种做出正确鉴定。 大肠杆菌的复染 老师事先提醒过大肠杆菌不好染色，复染可延长时间。我们复染5分钟后镜检，发现染色效果不理想，于是小心地拆