现代基因工程_02从活细胞中纯化DNA介绍.pptVIP

为了得到高产量的细胞外λ噬菌体，培养物必须被诱导，以使所有细菌进入侵染循环中的溶解阶段，导致细胞死亡并将λ噬菌体颗粒释放到培养基中。 诱导过程通常是很难控制的，但是绝大多数实验用λ噬菌体的cI基因含有温度敏感突变.。 cI是将噬菌体DNA保持在整合状态所需要依赖的基因。 如果该基因突变失活，则cI基因就不能够再正常发挥作用并引起细胞溶解的发生。 在cI温度敏感突变中，cI基因在30℃时发挥作用，正常的溶源性能够发生。 在42℃时，cI温度敏感突变基因就不能够再正常工作，溶源性也就不能够继续保持。 因此，被携带cI温度敏感突变的λ噬菌体侵染的大肠杆菌培养物，在从培养温度30℃提高到42℃时，就能够被诱导产生细胞外噬菌体。 2.3.2 非溶源性λ噬菌体的制备 绝大多数的噬菌体都是溶源性噬菌体， 但很多源自λ噬菌体的克隆载体都经过了改造，切除了cI以及其他一些基因，以消除细菌的溶源性。 因此这些噬菌体就不能够整合到细菌基因组中，并且只能够通过细菌溶解循环来侵染细胞。 对于溶解性噬菌体来说，获得高浓度的关键在于培养物的生长方式，尤其是在细胞被外源噬菌体颗粒侵染的阶段。 如果噬菌体在细胞分裂达到其最大分裂速度之前加入，所有细胞都会立刻溶解，这样得到的噬菌体浓度非常低。 另一方面，如果细胞密度太高的情况下加入噬菌体，培养物不能够彻底溶解，所得的噬菌体浓度也比较低。 理想的情况是，在培养物的生长时间，和噬菌体接种体的大小处于一种平衡状态。 即，培养物仍在继续生长，但最终所有的细胞都被侵染和溶解。 但，判断这种完美的生长状态需要一定的技术和经验。 2.3.3 从被侵染培养物中收集噬菌体 通过离心可以将已溶解细菌细胞的残留物，和一些不经意留下的未被侵染的细胞分离出来，而把噬菌体颗粒留在上清中。 但需要将悬液的体积减少到5mL或更少，以便更有利于进行DNA抽提。 噬菌体颗粒非常小，以至于必须用很高的离心转速才能够聚集，因此噬菌体的收集通常要在聚乙二醇(PEG)存在情况下沉淀得到。 聚乙二醇是一种长链多聚化合物，在盐存在下，能够吸收水分，使像噬菌体颗粒这样的大分子聚集沉淀。 这些沉淀能够通过离心被收集并在一个适当的小体积中重新溶解(图3-19)。 2.3.4 从λ噬菌体颗粒中纯化DNA 通过PEG沉淀再重新溶解造成的去蛋白作用，有时候对于提取纯净的噬菌体DNA来说已经足够了，但是通常λ噬菌体还要再经历一个中间的纯化步骤。 这一纯化步骤是必要的，因为PEG沉淀物仍然包含有一定的细菌残渣，这其中可能含有不希望有的环状DNA。 这些污染物能够通过CsCl密度梯度离心从λ噬菌体中分离出来，λ噬菌体以1.45-1.50g/cm3结合在CsCl梯度上(图3-20)，并且像前面描述的提取DNA条带方法那样从梯度中提取出来。 利用透析除去CsCl得到纯净的噬菌体制备物。 然后，既能够通过苯酚法也能够通过蛋白酶消化蛋白外壳，来实现DNA的抽提。 2.3.5 M13噬菌体DNA纯化的几个问题 M13噬菌体和λ噬菌体侵染循环存在很多不同，使M13拥有某些纯化的优势，这使得分子生物学家更希望制备M13噬菌体。 首先，M13噬菌体的双链复制模式，就像一个高拷贝数的质粒那样，非常易于通过标准的质粒纯化步骤进行纯化。 这些步骤包括：被M13噬菌体侵染的细胞提取物的制备，通过密度梯度(如EtBr-CsCl)离心从细菌DNA中分离出M13噬菌体。 相对于λ噬菌体，被M13侵染的细胞不断向培养基中分泌M13噬菌体，且永远都不会发生溶解，高浓度的M13噬菌体仅仅通过将细胞培养到一个很高的密度就能够达到。 事实上，不需要用到任何特别的技巧，就能够达到每毫升1012个M13噬菌体或更高的浓度。 这样高的浓度意味着大量的单链M13噬菌体DNA能够从小体积的培养基中获得，比如5mL或更小的体积。 而且，既然被侵染细胞不发生溶解，就不存在细胞残渣污染噬菌体悬液的问题。 因此，对λ噬菌体制备必要的CsCl密度梯度离心步骤，在M13噬菌体制备中很少需要用到。 总之，单链M13噬菌体DNA的制备包括： 小体积被侵染培养物的生长； 离心沉淀细菌； PEG沉淀噬菌体颗粒； 苯酚抽提分离噬菌体蛋白外壳； 乙醇沉淀浓缩制得DNA。 紫外吸收还被用来检测DNA的纯度。 纯净的DNA样品，在波长260nm和280nm的吸收量之比(A260／A280 )应为1.8。 如果实际测量时比例小于1.8，表示样品被蛋白质或苯酚污染。 2.1.6 从细菌外的生物体制备全细胞DNA 尽管各种来源细胞DNA的纯化基本步骤不变，但要考虑所用细胞的一些特性，并对实验步骤加以调整。 主要的调整发生在细胞破碎阶段。破碎细菌时所使