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分子生物学实验技术 主讲：琚春梅 Tel兽医学院微生物教研室 第一章 RNA的提取和cDNA的合成 RT-PCR原理及应用 一、RNA的提取 RNA易降解，在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性。 RNA酶稳定，并广泛存在，如各种组织、人的皮肤、手指、试剂、容器等。 采取的措施： 1、全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。 2、所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。 3、不能用高温烘烤的材料如塑料容器、试剂等可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理，然后高压灭菌以消除残存的DEPC 。 注意事项： 1、DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物。 2、DEPC能与胺和巯基反应，因而含Tris和DTT（二硫苏糖醇）的试剂不能用DEPC处理。 3、Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。 4、配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处理水配制，并尽可能用未曾开封的试剂。 总RNA提取方法（试剂盒）： 异硫氰酸胍－苯酚法（Trizol 法） 原理：首先用强变性剂异硫氰酸胍裂解细胞，同时使核蛋白复合体中的蛋白变性，释放出核酸。释放出来的DNA和RNA由于在特定pH时溶解度不同，分别位于整个体系中的中间相和水相，从而使DNA和RNA分离开来。进一步通过有机溶剂来抽提沉淀RNA，就可以得到纯净的RNA。 二、cDNA的合成 反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶 种类：两种 1、禽类成髓细胞病毒（AMV）反转录酶 包括两个多肽亚基（最适温度42℃） 活性：依赖于RNA的DNA合成，依赖于DNA的DNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分进行内切降解(RNA酶H活性)。 2、鼠白血病病毒(MLV)反转录酶 只有单个多肽亚基（最适温度37℃） 活性：依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性，但降解RNA:DNA杂交体中的RNA的能力较弱，且对热的稳定性较AMV反转录酶差。 MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。 cDNA引物 种类： 1、随机六聚体引物：不特异的引物 体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 2、Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的引物 绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物（12-18核苷酸）与其配对，仅mRNA可被反转录。 由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体引物得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。 3、特异性引物 用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 第二章 聚合酶链式反应（PCR） 一、PCR基本步骤 三个步骤： 1、变性(Denature)：双链DNA目的片段在94℃下解链。 2、退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对。 3、延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度(72℃左右)下，以目的DNA为模板进行合成。 二、PCR反应中的主要成分 引物：好坏是PCR成败的关键。 设计原则： 1、引物长度约为16-30bp 2、引物中G+C含量通常为40%-60%，粗略估计引物的解链温度Tm＝4(G+C)+2(A+T)，且接近72℃最好。 3、四种碱基应随机分布，在3端不存在连续3个G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区引发错误。 4、引物3‘-端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对。 5、在引物内，尤其在3‘-端应不存在二级结构，且3’-端尽量不用T，尤应避免连续2个或2个以上T，因为T引发错配的几率高。 6、两引物之间尤其在3‘-端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。 7、引物5-端对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点等，通常应在5-端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。 8、引物不与模板结合位点以外的序列互补。 引物浓度： 一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。 引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低 则降低产量。 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)： dNTP原液一般配成2.5-10mmol/L分装，-20℃贮存。 一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。 当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制T