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第六节 单链DNA内切酶 一、S1核酸酶 1. 来源 稻谷曲霉（Aspergillus oryzae）。 2. 特性 （1）高度单链特异性 （2）反应条件 ① 低水平Zn2+ ② pH4.0~4.5 3. S1核酸内切酶的功能 （1）降解单链RNA或DNA。 （2）切掉双链核酸中的单链区。 S1 S1 发卡或有缺口的部位。 （4）不能降解双链DNA或RNA-DNA杂交链 ATGCAT GCATGC TACGTA CGTACG T 甚至能识别单个核苷酸的单链区！ （3）降解限制酶切形成的单链突出端。 4. S1核酸酶的用途 （1）定位RNA DNA RNA S1 S1 200bp 400bp 某限制酶切后再与RNA杂交 某限制酶位点（参照物） 内切酶位点不能位于内含子序列中！? RNA RNA位于某限制酶位点左200bp和右400bp。 RNA位置 不能配对的内含子区域形成的单链环被S1切掉。 mRNA DNA （2）用mRNA测定基因中的外显子序列 二、Bal 31核酸酶 1. 来源 埃氏交替单胞菌（Alteromonoas espejiana） 2. 功能 既有单链特异的DNA（RNA）内切酶； 又有双链特异的DNA外切酶。 降解双链DNA或其上的单链缺口、未配对的单链区域。 4. Bal31的用途 定位测定DNA片段中的限制酶位点分布。 3. 反应条件 Mg2+、Ca2+ EGTA（乙二醇双四乙酸）专一性螯合Ca2+，可终止反应。 EcoR I EcoR I BamH I Hind III 与对照组（不用Bal31消化）只用相同的酶切的电泳比较。 根据酶切片段消失的先后顺序，判断这些片段在原DNA中的位置。 用Bal31消化线性DNA，并在不同的时间加入EGTA终止反应，再酶切电泳。 Bal31控制消化法： EcoR I EcoR I BamH I Hind III 分别用各个内切酶切后电泳，记录片段数目和大小。 EcoR I BamH I Hind III Marker EcoR I EcoR I BamH I Hind III EcoR I EcoR I BamH I Hind III Bal31 分别用原内切酶切后电泳，判断片段数目和大小。 Hind III EcoR I BamH I Marker （a）与S1酶相同点：作用于ss-DNA和RNA，对5’-端的突起核苷酸作用速度为GCAT （b）与S1酶的不同点：最适pH接近中性，不会产生切口; 不使具切口的ds-DNA断裂 （c）用途：与S1酶相同 三、绿豆核酸酶 (1) 甲基化酶的种类与识别顺序 a. 限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶 三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤： 在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。 如： M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同 M．HpaI C mCGG HpaI C CGG 相同 第七节 DNA甲基化酶 (methylase) DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase) 1．Dam 甲基化酶Dam 甲基化酶可在 GmATC 序列中的腺嘌呤 N6 位置上引入甲基。 一些限制酶（BamHⅠ、BglⅡ、MboⅠ）的识别位点中含 GATC 序列， 另一些酶 XbaⅠ（1/16）、MboⅠ（1/16）等部分识别序列含此序列，如平均16个XbaⅠ位点中TCTAGANN就有一个该序列。 b. E.coli 中至少有三个位点特异的甲基化酶 在多数E.coli有三个位点特异性的DNA甲基化酶。 dam 5’G mATC3’，dcm C mCA/TGG ，EcoKI甲基化酶 AmAC(N)6GTGC 2．Dcm 甲基化酶Dcm 甲基化酶识别 CmCAGG 或 CmCTGG 序列，在第二个胞嘧啶 C 的 C5 位置上引入甲基。 受 Dcm 甲基化作用影响的酶有 EcoRⅡ（↓CCWGG）。大多数情况下，其同裂酶 BstNⅠ（CC↓WGG）可不受影响，因为二者识别序列虽然相同，但切点不同。 受此甲基化酶影响的酶还有 Acc65Ⅰ、ApaⅠ、 EcoRⅡ 和 EaeⅠ 等。 不受此甲基化影响酶有 BanⅡ、 Bg1Ⅰ、 BstNⅠ、 KpnⅠ 和 NarⅠ 等。 有些限制酶对 Dam甲基化的DNA敏感，不能切割相应的序列，如 BclⅠ、 ClaⅠ、 XbaⅠ 等。 对甲基化不敏感的有BamHⅠ、Sau3AⅠ等