CRISPR-Cas9基因靶向修饰摘要.pptVIP

* 中山大学生命科学学院 CRISPR-Cas9系统基因定点修饰技术 汇报人：吴学能 1.CRISPR-Cas 概述 CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats），意为规律成簇间隔短回文重复，实际上就是一种基因编辑器，是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统，也是一种对付攻击者的基因武器。 后来，研究人员发现，它似乎是一种精确的万能基因武器，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因，这些目标基因包括人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞内的基因，这也意味着基因编辑器是一种可以广泛使用的生物技术。 CRISPR 是一个特殊的DNA重复序列家族, 广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR 位点通常由短的高度保守的回文重复序列(repeats) 组成, 重复序列的长度通常 21~48 bp, 重复序列之间被 26~72 bp 间隔序列(spacer)隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列（space）与靶基因进行识别。 CRISPR 结构 通过对CRISPR簇的侧翼序列分析发现，在其附近存在一个多态性家族基因。该家族编码的蛋白质均含有可与核酸发生作用的功能域(具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性)，并且与CRISPR区域共同发挥作用，因此被命名为CRISPR关联基因(CRISPR associated)，缩写为 Cas 。目前发现的 Cas 包括Cas1～Cas10等多种类型。 Cas基因与CRISPR共同进化，共同构成一个高度保守的系统。 Cas 结构 CRISPR-Cas 系统原理 Cas蛋白主要是一种降解DNA分子的核酸酶，含有两个酶切活性位点，每个位点负责剪切靶基因DNA双螺旋中的一条单链。 CRISPR在细菌中主要依赖 crRNA (CRISPR RNA) 和 tracrRNA (trans-activating chimeric RNA) 对外源DNA进行特异的识别，然后使Cas9蛋白对 序列进行特异的切割降解。 crRNA：能够与tracrRNA配对，形成RNA双链结构，这种双链RNA分子能够介导Cas9核 酸酶对与双链RNA分子互补结合的RNA进行切割 tracrRNA: 反式激活嵌合RNA,一种非编码RNA,能够促进crRNA的形成，是Cas9核酸酶发挥RNA介导DNA切割作用必不可少的辅助因子 加州大学Jennifer Doudna研究团队利用细菌中CRISPR-Cas系统获得性免疫工作原理，将 tracrRNA 和 spcer RNA 组合起来形成一个向导分子，即sgRNA (single-guide RNA),然后将其与Cas9蛋白混在一起，成功的对特定的DNA位点进行切割。 我们实验室，用的是Bsa 1这个酶切位点，它不像普通的酶切位点，不是回文序列，所以不存在连接顺序正反的问题。 pre-crRNA转录的同时，与其重复序列互补的反式激活tracrRNA (Trans-activating crRNA，)也转录出来，并且激发Cas9和双链RNA特异性RNase III核酸酶对pre-crRNA进行加工。加工成熟后，crRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体，识别并结合于crRNA互补的序列，然后解开DNA双链，形成R-loop，使crRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最终引入DNA双链断裂。 Cas9内切酶诱发DNA双链修饰 Cas9核酸内切酶特异切割目标基因组双链，产生基因组双链损伤DSB（Double-Strand Breaks），从而引起DNA损伤修复机制。 由于修复过程中是双链修复，没有模板供体，是一种易错修复。在修复过程中会随机引入或者删除核苷酸对，造成移码突变，从而实现基因突变，实现基因敲除。 目标基因双链损伤还能启动同源重组修复，如果此时能提供同源模板供体（donor）,供体可以是我们需要的点突变、保守区替换、标记基因等（GFP、HA ），就能实现基因组特定位置的基因敲入。 有文献报道，CRISPR/Cas9的切割是通过向导RNA(gRNA)与基因组位置之间20bp碱基的配对，且配对碱基的5′端需要有PAM结构(NGG)，再引导Cas9作用实现的，但是CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于gRNA与靠近PAM处10-12b