分子标记技术预案.pptVIP

1.1分子遗传标记 从广义上，是指可遗传并可检测的DNA序列或蛋白质 从狭义上，是指DNA标记，这个界现在别广泛采纳 具有分辨率好和信息量大等优势的分子遗传标记目前已广泛应用于生物基因组研究以及生物遗传育种、进化起源、分类等诸多方面。 1.2DNA分子标记的定义及特征 定义：指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异 特征：不受环境和其他因素的影响； 多态性几乎遍布整个基因组；不受基因表达与否的影响，具有数量丰富、多态性强及操作简单等特点 二 DNA分子标记技术及其应用 第一代分子标记技术 第二代分子标记技术 第三代分子标记技术 几种新型分子标记技术 2.1第一代分子标记技术 以Southern杂交为核心的分子标记技术 RFLP标记是最具代表性的一代分子标记技术，也是最早应用的DNA分子标记技术 原理：用已知的限制性内切酶酶解样品DNA，产生许多大小不等的DNA片段，电泳分离、Southern印迹转移到硝酸纤维膜上，再经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交，放射自显影，显示出不同材料的多态性图谱 RFLP标记技术的特点 RFLP标记呈现共显性遗传 缺点：步骤繁杂，工作量大，且DNA的需要量大，在很大程度上限制了该技术的应用 2.2 第二代分子标记技术 随机引物PCR标记 RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，DNA随机扩增多态性） RAPD具有技术简单、检测迅速、灵敏度高、特异性强、检测容易、DNA样品用量少的优点，但RAPD为显性遗传，侧你在共迁移问题，并且重复性较差 RAPD技术原理：利用随机引物（8~10个碱基）通过PCR反应非定点地扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分离扩增片段来进行DNA多态性研究 随机引物PCR标记 ISSR（Inter simple Sequence Repeats,内部简单重复序列） ISSR基本原理利用人工合成的16~18个核苷酸重复序列作为引物，对SSR之间的DNA片段进行PCR扩增 ISSR在引物设计上比SSR简单，无需知道DNA序列就可用引物扩增，还比RFLP、RAPD、SSR提供的遗传信息更多，但多数情况下，不能区别一个位点扩增的DNA片段 特异引物PCR标记 SSR（Simple Sequence Repeats,简单重复序列） SSR基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率 特异引物PCR标记 STS（Sequence tagged Site，序列标记位点） STS是将RFLP的标记技术转化为基于PCR的方法，通过设计一对长度约20bp的特异引物，对基因组DNA进行扩增 STS标记技术，一旦获得引物，就和RAPD一样简单迅速 限制性酶切片段的选择性扩增来显示片段长度的多态性——AFLP AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism,扩增片段长度多态性） AFLP基本原理：对DNA限制性酶切片段进行选择性扩增 AFLP指纹呈孟德尔式共显性和显隐性遗传 AFLP兼具RAPD与RFLP优点，有较高的稳定性 对PCR扩增片段的限制性酶切来揭示扩增区段的多态性——CAPS CAPS（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence,放大剪切序列多态性） CAPS是在RAPD技术的基础上发展起来的 CAPS标记为共显性遗传 CAPS标记使用的引物长，因此可重复性高，比其他利用随机引物的方法在基因定位和作图中的应用要好 2.3 第三代分子标记技术 基于单核苷酸多态性的DNA分子标记 SNPs（Simple Nucleotide Polymorphisms,单核苷酸多态性） 同一位点的不同等位基因之间常常只有一个或几个核苷酸的差异，从分子水平上单个核苷酸的差异进行检测具有重要意义 检测SNPs方法a.随机扩增DNA（RAPD）法 b.DNA芯片（DNA-chip）检测法 2.4几种新型分子标记 RGAs标记（Resistance Gene Analogs,抗病基因类似物） RMAPD标记（random microsatellite amplify polymorphic DNA,随机微卫星扩增多肽） SRAP（Sequence Related Amplified Polymorphism,相关序列扩增多态性） TRAP标记（Target Re