第六章基因的重组与转移说课.ppt

第六章基因的重组与转移 第一节 受体细胞 第二节 重组体导入受体细胞 2. 菌种的选择 3. 制备原理 4. 制备过程 2. 转化率 （1）热休克法 （2）电转化法 4. 平板培养基培养细菌 5. 影响转化率的因素 （2）感受态细胞 （competent cells) 6. 体外包装的噬菌体的转导 第三节 外源基因导入真核细胞 2. 酵母的转化方法 （2）利用Li+盐进行转化 二、导入植物细胞 2. 电击法（electroporation) 3.基因枪法（gene gun） 三、导入哺乳动物细胞 （2）特点： 2. 脂质体（lipofectin）载体法 3. 显微注射法(microinjection) 4. DEAE---葡萄糖传染法 外源基因导入细胞的方法 酵母 0.1mol/L LiCl处理 插入外源基因的酵母载体 感受态 40% PEG 4000 叶盘 消毒 切取 土壤农杆菌浸泡 看护培养基 愈伤组织 分化幼苗 1. 叶盘法（leaf disk） 植物细胞 原生质体 纤维素酶和果胶酶 DNA 混合入电击缓冲液 1-2kV, 3-25?F电击 愈伤组织 幼苗 分化 又称高速微型子弹射击法（High-velocity microprojectiles) DNA 1.2?m钨弹头 吸附 特制手枪 射击植物 装入 4. 农杆菌（agrobacterium）介导 （1）原理： 1. 磷酸钙沉淀法 HEPES缓冲盐水与含有氯化钙和DNA的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和DNA的沉淀。 依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀。 不需要载体。 脂质体有商业试剂盒（如Life Technologies）。 脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。 直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。 * * 外源DNA 载体DNA 重组分子 原核细胞 真核细胞 扩增或表达 表达 连接 转化或转导 电穿孔或显微注射 受体细胞 一、什么是受体细胞（receptor cell）? 又称host cell，从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定遗传的细胞； 从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。 显然并不是所有细胞都能作为受体细胞 二、受体细胞的选择应符合哪些基本原则？ 九大原则！ 1、便于重组DNA分子的导入。 2、能使重组DNA分子稳定的存在于细胞中 3、便于重组体的筛选。 4、遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长 5、安全性高无致病性，不会对外界环境造成生物污染 6、选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞。 7、受体细胞在遗传密码的应用上无明显偏倚性 8、具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。 9、在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。 三、目前常用的受体细胞？ 这些受体细胞各有哪些特点？ 1、大肠杆菌 2、枯草杆菌 3、蓝细菌 4、棒状杆菌 5、链霉菌 原核生物细胞 6、酵母菌 7、植物细胞 8、动物细胞 真核生物细胞 原核生物细胞？ 这是较为理想的受体细胞类型！ 没有坚硬的细胞壁 原 因 没有核膜，染色体DNA没有固定 结合的蛋白质 基因组简单，不含线粒体基因组 培养简单、繁殖迅速， 实验周期短，重复实验快 原核生物细胞？ 原核生物细胞作为受体存在的缺陷！ 不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统 原 因 缺乏真核生物的蛋白质加工系统 存在内源性蛋白酶 真菌细胞—酵母菌 外源真核基因最理想的表达系统 基因表达调控机理比较清楚 优 势 具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统 不含有特异性的病毒，不产生毒素 培养简单、利于大规模发酵生产，成本低廉 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 植物细胞 优 势 具有全能性 动物细胞 用于大规模表达生产天然状态的复杂蛋白质或动物疫苗、动物品种的遗传改良及人类疾病的基因治疗等 能识别和除去外源真核基因中的内含子 优 势 真核生物蛋白翻译后能被正确加工或修饰 易被重组DNA质粒转染 可将表达产物分泌至培养基中 组织培养技术要求高 缺点 研究性作业 题目：国内外利用不同受体细胞开发生物 反应器的研究进展情况 基本内容要点： 1、目前国内外都开发了哪些受体细胞作为生物反应器，并分别用它们生产了哪些基因工程产品？为什么要选择它作为生产该产品的反应器？ 2、生物反应器这一领域目前存在哪些问题？将来发展趋势如何？ 3、目前，国内外有哪些从事生物反应器开发的企业？你认为 如果今后你去这里求职应该从知识上做哪些储备？ 要求：中文参考文献不少于20篇 英文参考文献不少于5篇 一、重组DNA分子转入原核生物细胞 二、重组DNA分子转入真核生物细胞 一、如何将重组DNA分子转入原核生物细胞？ 以大肠杆菌为例 转化途径 转导途径 什么是转化（t