第六章基因工程DNA测序说课.pptVIP

第六章 DNA序列分析 §1 Sanger双脱氧链终止法 §2 DNA片段序列测定的策略 第一节 Sanger双脱氧链终止法 (chain-terminator method) 1977年Sanger充分利用DNA复制的生物学特性,设计了一种通过DNA复制来识别4种碱基的方法,进行DNA序列测定,即双脱氧链终止法。 Fredrick Sanger因此获得1980年诺贝尔化学奖。 一、Sanger双脱氧链终止法原理 Sanger法的几个基本特征： 特异引物在DNA聚合酶测序中的应用 控制底物u的掺入，来实现碱基特异的链终止 用PAGE分辨长度仅差1个base的单链DNA 一、Sanger双脱氧链终止法原理 Sanger dideoxyl-chain termination sequencing 二、Sanger双脱氧链终止法的要素 测序的5个步骤： 模板的变性 引物的退火 引物的标记或ddNTP的标记 DNA链的延伸和终止 SDS电泳 1.双脱氧终止法测序反应体系包括： DNA聚合酶 单链DNA模板 带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物 4种dNTP(aATP,dGTP,dCTP和dTTP) 1种ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP或ddTTP) 2.测序反应的种类 ① T7 DNA polymerase reaction ② Taq DNA polymerase reaction 第二节 DNA片段序列测定的自动化 * * 2′, 3 ′-dideoxynucleoside triphosphate, ddNTP This figure shows the structure of a dideoxynucleotide (notice the H atom attached to the 3 carbon). Also depicted in this figure are the ingredients for a Sanger reaction. Notice the different lengths of labeled strands produced in this reaction. This figure is a representation of an acrylamide sequencing gel. Notice that the sequence of the strand of DNA complementary to the sequenced strand is 5 to 3 ACGCCCGAGTAGCCCAGATT while the sequence of the sequenced strand, 5 to 3, is AATCTGGGCTACTCGGGCGT  二、Sanger双脱氧链终止法的要素 DNA测序实现规模化的重要条件是自动化和机械化。 目前，在亚克隆筛选、模板制备、测序反应、碱基阅读等方面均在一定程度上实现了自动化。 目前的关键是把全基因的散测序组装起来，以实现DNA测序的完整性。