第五章目的基因的获取扩增与检测及相关技术简综合待修研讨.ppt

第五章 目的基因的获取、扩增 与检测及相关技术 1、物理化学方法 2、鸟枪法 3、化学合成法 4、基因文库 5、逆转录合成 6、 PCR技术 7、凝胶电泳 8、酵母双杂交系统9、杂交技术 10、生物芯片 11、 DNA测序 第一节 目的基因的获取及相关技术 一、物理化学方法 二、鸟枪法 三、化学合成法 四、凝胶电泳 五、PCR技术 六、基因文库（基因组文库、cDNA文库） 七、逆转录合成 八、酵母双杂交系统 四、凝胶电泳 五、PCR技术 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）： 20世纪70年代，Khorana首先提出设想， 1983年，美国Cetus公司的Mullis等人创立该技术，并在8年后因此技术获得了诺贝尔奖。 PCR为分子生物学领域带来了一场重大变革。 1、PCR反应体系组成 2、PCR反应过程 3、应用 1、PCR反应体系组成 （1）作为模板的DNA，即DNA模板； （2）寡聚核苷酸引物，要求与被分离（扩增）的目的基因两条链各一端序列互补配对； （3）有热稳定性的DNA聚合酶，如TaqDNA聚合酶； （4）4种dNTP，N=A、G、C、T； （5）反应缓冲液，Tris.HCl（pH8.3），含Mg2+。 寡聚核苷酸引物核苷酸长度：15-30个核苷酸，G+C 45%-55%，Tm在55 ℃以上。 寡聚核苷酸引物核苷酸顺序的确定方法： ★网上基因数据库查询； ★由基因所编码的蛋白质氨基酸序列密码子反推。 2、PCR反应过程 （1）变性：将模板置于95℃的高温下，使双链DNA解链变成单链DNA； （2）退火：将反应体系的温度降至55 ℃左右，使一对引物分别与变性的两条模板链相配对； （3） 延伸：将反应体系的温度调到TaqDNA聚合酶作用的最适温度72℃，然后以目的基因为模板，合成新的DNA链。 如此反复进行30个循环，可扩增得到大量的目的基因，以2n倍增。 PCR技术原理示意图 PCR的基本反应步骤 3、应用 基因扩增 大量获得（制备）目的基因 基因检测 六、基因文库 1、基因文库的基本概念 2、基因文库的构建过程 3、基因文库中目的基因的筛选 1、基因文库的基本概念 是含有某种生物体全部基因的随机片断的重组DNA克隆群体。 根据构建方法的不同，基因文库分为： （1）基因组文库（含有全部基因） （2） cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因） complementary DNA（互补DNA） 克隆数的确定（基因文库的容量） 任一DNA序列在文库中出现的概率： N:该序列需要克隆的总数； p:任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率，一般为99％； I：待克隆DNA片段的长度，假定为17kb; G: 基因组DNA的总长度，如人类为3×109bp 将数据代入上式 = 8.1×105 N的含义是克隆大小为17kb的人类DNA时，所构建的基因文库数必须在 8.1×105 以上时，才能以99％的概率得到此克隆。 2、基因文库的构建过程 （1）基因组文库的构建 （2） cDNA文库的构建 （1）基因组文库的构建 构建基因组文库时先提纯生物的总DNA，通过机械剪切或酶切使其成为一定大小的片段，连接到适当载体(常为?噬菌体)上，经体外包装转染细菌，得到一群含不同DNA片段的重组噬菌体颗粒。此即是基因文库。这群DNA片段含盖基因组全部基因。 噬菌体为载体的基因文库的构建 基因组文库的构建过程 ①生物基因组DNA的提取和片段化 ②载体的选择和制备 ③DNA片段和载体的连接 ④重组体转化宿主细胞 ⑤初库的扩增 ①生物基因组DNA的提取和片段化 用限制酶片段化： 1～3kb， 10～30kb 随机片段化：超声波（ 300bp ）、高速搅拌（ 8kb ） ②载体的选择和制备 ③DNA片段和载体的连接 ④重组体转化宿主细胞 用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌 ⑤初库的扩增 柯斯质粒(cosmid)载体 基础：包含λ噬菌体cos位点的质粒； 导入宿主：经体外包装，再转染宿主细胞； 供体DNA大小：30-45kbp。插入大小范围被有效形成噬菌斑的野生型基因组 75-105％所限制。 主要应用：基因组文库构建。 酵母人工染色体(yeast artificial chromsomes, YAC) 基础：酿酒酵母中心粒、端粒和ARS 导入宿主：转化酵母原生质体