第十三章核酸的生物技术研讨.pptVIP

基因组DNA的分离与制备 基因重组技术 基因重组技术 基因工程的操作技术 基因重组技术 DNA序列分析 DNA序列分析 核酸的杂交技术 Southern和Northern杂交技术 Southern和Northern杂交技术 * 本章简介 要点回顾 掌握内容讲授 第四部分 核酸生物技术 本部分主要介绍核酸的生物技术——核酸的分离纯化、PCR技术、基因重组、DNA的序列分析、核酸的杂交技术。 1、基因组DNA的分离与制备、DNA的琼脂糖凝胶电泳 2、聚合酶链反应（PCR） 3、基因重组技术 4、DNA的序列分析 5、核酸的杂交技术 重组DNA技术是利用载体系统人工修饰有机体遗传组成的技术，即在体外通过酶的作用重组异源DNA与载体DNA，并将重组DNA分子导入受体细胞内，以扩增异源DNA，并实现其功能表达的技术。 基因重组的大致顺序为：（1）从供体细胞分离出DNA并切下需要的信息部分；（2）从受体细胞分离出称为质粒的环状DNA；（3）切下质粒的部分DNA；（4）把供体的DNA片段连接到质粒DNA缺失的部分；（5）把重组好的质粒送回受体细胞中增殖，功能基因表达。 Foreign DNA to be inserted Plansmid vector Joining Recombinant DNA molecule Introduction into host cells by transformation of viral infection Host chromateme Slection for cells coteining a recombinant DNA molecule Cloning + 1、体外基因重组 ? 目的基因的制备? 载体的构建：质粒或噬菌体 ? 目的基因与载体重组 2、重组体DNA的转化增殖和表达 ? 转化 ? 筛选? 增殖和基因表达 DNA测序技术主要依据Sanger的双脱氧链终止法。?以DNA单链为模板，在DNA复制反应体系中加入双脱氧核糖核苷酸(ddNTP)，这种23ddNTP的5-磷酸基团是正常的，而3位置缺少羟基，因此在DNA聚合酶作用下，仍然可以通过5-磷酸基团与引物链的3-羟基反应掺入到引物链中，但是由于ddNTP没有3-羟基，不能继续与下一个5-磷酸基团形成磷酸二酯键而导致引物链延伸的终止。这样在测序反应体系中，DNA引物链不断合成与偶然终止，产生一系列长短不等的核苷酸链。然后将这些测序反应产物进行电泳。 将变性DNA经退火处理，两条来源不同的单链核酸（DNA或RNA），只要它们有大致相同的互补碱基顺序即可复性，形成新的杂种双螺旋——核酸的分子杂交。核酸杂交可以是DNA-DNA，也可以是DNA-RNA杂交。常用的核酸分子杂交技术有：原位杂交、斑点杂交、Southern杂交及Northern杂交等。在核酸杂交分析过程中，常将已知顺序的核酸片段用放射性同位素或生物素进行标记，这种带有一定标记的已知顺序的核酸片段称为探针。 Southern/Northern杂交技术：指将经过电泳分离的DNA/RNA片断转移到一定的固相支持物的过程。 步骤如下：1、用限制性内切酶消化大分子DNA/RNA；2、用琼脂糖凝胶电泳对DNA/RNA片段按分子量大小分离；3、将DNA/RNA片段在琼脂糖凝胶电泳中变性成单链后，再转移到适当的固相支持物上并与之结合；４、探针与膜上的DNA/RNA杂交；５、检测。 *