电泳实际操作指导介绍.ppt

琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像实验步骤 1、具体步骤 ?1 打开凝胶成像仪电源（机器后部），开电脑； ?2 将染色后凝胶用水冲洗后，将凝胶放在透射板正中， 并关严暗仓门，打开紫外灯； ?3 打开Quantity one软件，点击basic，File中选择 Get Doc EQ…，调节使图象到达合适亮度、大小及清晰度； ?4 待图象最优化时，成像freeze在屏幕上，关闭紫外灯， 点击“Save”保存； ?5 关闭软件； ?6 打开暗仓门，拉出透射台，凝胶丢弃至专门垃圾桶， 插掉透射板上水迹； ?7 关上暗仓门。 2、Quantity One 软件 是The Discovery Series 软件家族的成员，它是一 个功能强大的灵活软件包，可成像和分析一维电泳凝胶、斑点印迹、狭线 印迹和菌落计数。 Quantity One 软件能定量和分析多种数据，包括从光密 度仪、储能磷屏成像仪、荧光成像仪和凝胶成像系统采集的放射性、化学 发光、荧光和染色等样品。Quantity One提供自动分析功能以快速获取高 质量结果。 3、注意事项 ?1 开关仓门时防止将EB沾在仓门盖上; 2 透射板紫外灯寿命有限，调整图象后及时成像； ?3 凝胶应及时清理，防止凝胶固化后贴附在透射板上，造成成像不清晰； 4 成像结束后插掉透射板上水迹，防止仪器内部生锈引起短路。 * * 凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术。根据制备凝胶的材料: 琼脂糖电泳 凝胶 电泳 聚丙烯酰胺电泳 一、琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖的孔径大，可以分离长度为100bp至60kb的核酸片断； 聚丙烯酰胺凝胶的孔径小，可分离小片断（5-50bp）的核酸。 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。在外加电场作用下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。 1、实验原理 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。 琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA， 也可以分离相对分子质量相同，而构型不同的DNA分子。 溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。 注意事项： EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。 实验过程中操作要保持安静，注意样品不能混样。 2、实验步骤 ⑴ 1g 琼脂糖加入100ml 1×TAE电泳缓冲液中，摇匀，在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。 ⑵ 将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固。 ⑶ 充分凝固后小心垂直向上拔出梳子。将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm。 ⑷ 用移液器吸取总DNA或质粒样品xμl于一次性手套上，再加入一定量的6X/10X loading buffer，混匀后，小心加入点样孔。每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序）。 ⑸ 打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min：当指示剂跑过胶板的2/3，可终止电泳。 ⑹ 将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。 ⑺ 将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。 植物总（核）DNA样品 应呈现一条迁移率很小 的整齐条带。 质粒DNA的存在形式有3种： ① 共价闭环DNA（cccDNA），常以超螺旋形式存在； ② 开环DNA（ocDNA），此种质粒DNA的两条链中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力，形成松弛的环状分子； ③ 线状DNA，因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成。因此质粒DNA电泳的结果中有可能出现三条泳带，它们的泳动速度为：cccDNA 线状DNA ocDNA。 原质粒 酶切后质粒 ocDNA 线状DNA cccDN