动物细胞融合细胞核的分离与鉴定概述.ppt

设计型实验设计报告小组成员：熊振（1320150202） 叶小艳（） 曾曼曼（） 王东海（1320150141） 周宇锋（1320150140） 细胞核的分离和鉴定 * 动物细胞融合 细胞融合是正常的生命活动 受精作用 两个细胞正在融合 动物细胞融合基本过程： 诱导方法： 诱导方式 物理法： 化学法： 生物法： 灭活的病毒 电刺激 聚乙二醇PEG 聚乙二醇PEG具有强烈的吸水性以及凝聚和沉淀蛋白质的作用，能够有效地促进植物原生质体和动物细胞的融合。在不同种类的动物细胞混合液中加入聚乙二醇，就会发生细胞凝集作用；在稀释和除去聚乙二醇的过程中，就会发生细胞融合。聚乙二醇诱导细胞融合的机理，目前还不太清楚。聚乙二醇是化学试剂，使用起来很方便，诱导细胞融合的频率比较高，但是它有一定毒性，对有些细胞(如卵细胞)不适用。 聚乙二醇PEG诱导融合 实验原理： 利用PEG介导的动物细胞融合，其实验原理到目前为止还没有完全定论。学者们一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的重排质膜，在修复时相互合并在一起, 使两细胞的胞质沟通, 从而造成相互接触的细胞之间发生融合。 利用PEG介导细胞融合, 其融合效果受以下几种因素的影响： PEG的分子量与浓度: 细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比；但PEG的分子量越大、浓度越高, 对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000~4000，浓度一般为40~60%。 2. PEG的pH值: 经验证，PEG的pH值在8.0~8.2之间融合效果最好。 3. PEG的处理时间: 处理时间越长，融合效果越好, 但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。本实验中细胞融合后无需继续培养, 故处理时间可适当放宽至数分钟。 4. 融合时的温度: 由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正比。因此，为了获得更好的融合效果, 在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于哺乳动物的细胞, 一般采用的温度为38~40℃。 而本次试验基本在37 ℃的条件下进行。 实验选材： 本次试验选用鸡的外周血做细胞融合材料, 这是因为: 1. 鸡血细胞具有细胞核，便于对融合细胞进行鉴别； 2. 实验材料便宜、易得，避免了用培养的细胞株做细胞融合实验材料所耗的实验成本和精力； 3.细胞融合与否，可通过观察细胞内核的数目来进行鉴别。若细胞内只有一个核，定为未融合细胞；有二至多个核，定为融合细胞。 实验步骤： 取新鲜鸡血, 制成体积分数10%鸡红细胞悬液。 称0. 5gPEG(MW=4000)，熔化。尽快加入0.5ml预热80℃ 的Hanks 液，制成质量分数50%PEG，轻轻摇匀，散温， 置37℃恒温水浴箱中备用（以防冷却后会形成结晶）。 吸取1 mL 悬液置刻度离心管中, 另加5 mL Hanks 液,混匀, 离心（1000r/min）5min 。 吸取0. 5mlPEG加入鸡红细胞沉淀管内， 1min内加入离心管中，边滴边摇晃 （此过程必须在37 ℃水浴箱中进行）。 静置1min后，加入9mlHanks液，轻轻 吹打混匀，在37 ℃水浴箱中放置10min。 吸弃上清液，使沉淀物松散，置37℃水浴箱中维持。 离心（1000r/min）5min,吸弃上清 液，加入1ml不含血清的1640培养液， 混匀后取1滴悬液制成临时装片。 用质量分数为0.12%的次甲基蓝染色。镜检。 离心（1000r/min）5min,吸弃上清液， 加入3ml含小牛血清的1640培养液，轻轻吹 打混匀，置37 ℃水浴箱中温育30min。 注意事项： 1、注意PEG浓度和作用时间等，即在制备鸡红细胞沉淀物时，一定不要有残留的液体存在，并且要在37 ℃水浴锅中于15min内全部滴完PEG，这样融合的效果最好； 2、制备50%PEG完后，需置于37 ℃恒温水浴箱中备用，以防冷却后会形成结晶； 讨论： 经过小组成员内部讨论和查阅资料，我们对细胞融合实验的选材有了补充：我们也可以用蟾蜍血红细胞进行这项实验，并且蟾蜍血红细胞也易取得。同时也可做蟾蜍血红细胞与鸡血红细胞的融合实验，但实验试剂需要改变： 1、Alsver液：葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.8g，氯 化钠0.42g，加重蒸水至1