大肠埃希氏菌计数产气讲义.pptVIP

大肠杆菌的定义 广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在44.5℃发酵乳糖产酸产气、 IMViC生化试验 (靛基质、甲基红、VP试验、柠檬酸盐)为+ + - -或- + - -的革兰阴性杆菌。 卫生学意义 大肠杆菌的某些菌株对人有致病性。 相对于大肠菌群和粪大肠菌群，大肠杆菌与粪便污染的相关性最好，是指示粪便污染最理想的指标，应用也最悠久。自1892年被提议作为粪便污染的指示菌以来，已被应用了100多年 。 为什么后来又有了大肠菌群和粪大肠菌群的应用？主要的原因是因为大肠杆菌的检验过于复杂。 随着食品卫生标准的日益科学和细化，以及对大肠杆菌检验方法的不断改进，对特定食品的大肠杆菌的检验需求肯定会越来越多。 可作为评价消毒效果的指示菌。 大肠杆菌的生化特性 形态与染色： 革兰染色朱阴性无芽胞的短小杆菌；多数菌株有5~8根鞭毛，能运动。少数菌有荚膜。 培养特性： 需氧或兼性厌氧。最适温度37℃，但在46℃也能生长。最适pH7.4~7.6。 大肠埃希氏菌计数 GB 4789.38-2012 “大肠杆菌VRBA—MUG平板计数”改为“大肠 埃希氏菌平板计数法” 删除大肠杆菌PetrifilmTM测试片计数法 GB478.38-2012大肠杆菌计数 第一法：MPN法 第二法：大肠埃希氏菌平板计数法 GB4789大肠杆菌计数MPN法检验程序 样品的稀释 固体和半固体食品：称取25g样品，放入盛有225 mL生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，于8000~10000 r/min均质1min～2min，或放入盛有225 mL生理盐水的无菌均质袋中，用均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。 样品匀液的pH值应在6.5~7.5之间，必要时分别用1.0mol/L氢氧化钠或1.0mol/L盐酸调节。 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1mL，沿管壁徐徐注盛有9mL磷酸盐缓冲液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用一支1mL无菌吸管或吸头反复吹打，使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至接种完毕，全过程不得超过15min。 初发酵试验 选择适宜的三个连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液）。每个稀释度接种3管LST肉汤，每管接种1mL（如接种量需要超过1 mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察小导管内是否有气泡产生，如未产气继续培养至48h±2h。记录在24h~48h内产气的LST管数。如所有LST肉汤管均未产气，即可报告大肠杆菌MPN结果；如有产气者，则进行复发酵试验。 复发酵试验 用接种环分别从所有48h±2h内发酵产气的LST管取培养物1环，移种到已提前预温至45℃的EC肉汤管中，放入带盖的44.5℃±0.2℃水浴箱内，水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养24h±2h，检查小导管内是否有气泡产生，如未产气继续培养至48h±2h。记录在24h和48h内产气的EC肉汤管数。如所有EC肉汤管均未产气，即可报告大肠杆菌MPN结果。如有产气者，则进行EMB平板分离培养。 伊红美蓝平板分离培养 轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物划线分离于伊红美蓝（EMB）平板。36℃±1℃培养24h±2h后，检验平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。 营养琼脂斜面或平板培养 从每个平板上挑选5个典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面或平板上，36℃ ± 1℃培养18h~24h，取培养物进行革兰染色和生化试验。 生化试验 靛基质试验：将培养物接种于蛋白胨水，36℃±1℃培养24 h±2h，加Kovacs靛基质试剂0.2~0.3ml，上层出现红色为阳性。 MR-VP试验：将培养物接种于MR-VP培养基，36℃±1℃培养48h±2h，移取培养物1ml至13mm×100mm小试管中，加5%α-萘酚乙醇溶液0.6ml、40%氢氧化钾0.2ml和少许肌酸结晶。振摇后静置2h，如出现伊红色为VP试验阳性。 将MR-VP试验剩余培养物再培养48h后，滴加5滴甲基红试剂，培养物变红为甲基红试验阳性；变黄为阴性。 柠檬酸盐利用试验：将培养物接种于Koser氏柠檬酸盐肉汤， 36℃±1℃培养96h±2h，记录有无细菌生长，生长为阳性。 大肠杆菌与非大肠杆菌的生化鉴别 大肠杆菌MPN计数的报告 大肠杆菌为革兰染色阴性无芽胞杆菌、发酵乳糖、产酸、产气；MIViC试验为++--或-+--。只要有1个菌落鉴定为大肠杆菌，其代表的LST肉汤管即为大肠杆菌阳性。 依据LST肉汤阳性管数查MPN表，报告每g或每ml样品