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第五章 灭菌 绝大多数工业发酵是需氧的纯种发酵，必须消除杂菌的污染。如发生杂菌污染会产生以下不良后果： ①杂菌消耗基质和产物，造成产率下降； ②杂菌的代谢产物或染菌后发酵液的某些理化性质发生改变，使产物提取变得困难； ③污染的杂菌可能会分解产物而使生产失败； ④污染杂菌可能会改变反应介质pH值，从而使生物化学反应发生异常变化； ⑤发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解而使生产失败。 第一节 灭菌的基本原理 灭菌是使用化学的和物理学的方法杀灭或除掉物料或设备中所有的有生命的有机体的技术和工艺过程。 应用范围有：培养基灭菌；气体灭菌；设备及管道灭菌等。 工业生产中常用的灭菌方法有化学物质灭菌、热灭菌(包括干热灭菌和显热灭菌)、辐射灭菌和过滤介质除菌。 (一)化学物质灭菌 原理：化学物质可与微生物细胞中的某种成分产生化学反应，如使蛋白质变性、酶类失活、破坏细胞膜透性而杀灭微生物。 适用情况：化学物质不适合用于培养基的灭菌，只适合于局部空间或某些器械的消毒。因为①培养基里含有蛋白质等营养物质亦易与上述化学物质发生化学反应，②同时药物加入培养基之后很难除掉。(高锰酸钾和甲醛) (二)辐射灭菌 辐射灭菌是利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀灭微生物。紫外线与菌体核酸发生光化学反应而造成菌体死亡。X射线、γ射线等，使菌体内的水和有机物产生强烈的离子化反应，形成OH、O2H根、过氧化氢和有机过氧化物，阻碍微生物的代谢活动而导致菌体迅速死亡。X射线的穿透力极强，但不经济，并且向四面八方辐射，不适于大生产使用。 (三)干热灭菌 干热灭菌是指在干燥高温条件下，微生物细胞内的各种与温度有关的氧化反应速度迅速增加，使微生物的致死率迅速增高的过程。160℃，1小时。主要用于器械、容器灭菌。 (四)湿热灭菌 湿热灭菌原理是直接用蒸汽灭菌。蒸汽冷凝时释放大量潜热，并具有强大的穿透力，在高温和水存在时，微生物细胞中的蛋白质极易发生不可逆的凝固性变性，致使微生物在短时间内死亡。由于湿热灭菌有经济和快速等特点，因此被广泛用于工业生产。 第二节 培养基和发酵设备的灭菌 主要介绍培养基的湿热灭菌 一. 微生物的死亡速率与理论灭菌时间 致死温度：杀死微生物的极限温度。 致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间。 热阻：指微生物在某一种特定条件下（主要指温度和加热方式）的致死时间。一般说灭菌是否彻底，是以能否杀死热阻大的芽孢杆菌为指标。微生物对热的抵抗力常用热阻表示。 1. 微生物的死亡速率 实验证明，微生物死亡的速率与残存菌数可用对数残留定律表示： 其中N ：培养基中的活菌个数 t：时间 k：比死亡速率，k值越大，表明微生物越容易死亡。 开始灭菌时，即 t=0时，培养基中 活菌数为N0。 积分上式： 2、理论灭菌时间 根据上述的对数残留方程式，如果要求达到彻底灭菌，即Nt=0，则所需的灭菌时间t为无限长，这在生产上是不可行的。因此，实际设计时常采用Nt=0.001(即在1000批次灭菌中只有1批是失败的)。 二、培养基灭菌温度的选择 在培养基灭菌的过程中，除微生物被杀死外，还伴随着营养成分的破坏，如糖液焦化变色、蛋白质变性、维生素失活、醛基和氨基反应、不饱和醛聚合、一些化合物发生水解等。因此，必须选择一个既能达到灭菌的目的，又能使培养基中营养成分破坏至最小的灭菌工艺条件。 首先，绝大部分培养基的营养成分的破坏属于一级分解反应，其反应动力学方程式为：dC/dt=?KC 反应速度常数与温度的关系也可用阿累尼乌斯方程式表示： 菌体死亡也属于一级动力学反应，其反应速度常数与温度的关系也可用阿累尼乌斯方程式表示： 当灭菌温度从T1升高至T2时，灭菌的反应速度常数K值和营养成分分解的反应速度常数K值的变化情况如下：K1→K2，K1→K2 经推导有下式： 由于杀死微生物的活化能E大于营养成分破坏的活化能E，所以随温度的升高，灭菌反应速度常数增加的倍数K2/K1大于营养成分破坏反应速度常数K2/K1增加的倍数，因而在较高温度下可以缩短灭菌时间而保留较多的营养物质。 例： 将芽孢杆菌和维生素B2放在一起灭菌的试验发现，当温度升至118℃，加热时间为15分钟，可杀死99.99％的细菌芽孢，维生素B2的破坏率为10％；而在温度120℃下加热1.5分钟，细菌芽孢的死亡率仍为99.99％，而维生素的破坏率为5％。 阿累尼乌斯获得了1903年诺贝尔化学奖 1901年，首届评选诺贝尔奖，物理奖的11个候选人之一，落选。1902年又被提名化学奖，也没被选上。1903年，评委很多人都推举阿累尼乌斯，但是，对于他应获得物理奖还是化学奖发生分歧。诺贝尔化学奖委员会提出给他一半物理奖，一半化学奖，这一方案过于奇特，被否定了。又提出他获奖问题延期至第二年，