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谢谢大家！ 实验十 细菌的生理生化反应 庞昕 山东大学微生物技术国家重点实验室 一、实验目的和要求 了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常用的生理生化反应的测定方法； 通过不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利用情况，了解细菌碳、氮代谢类型的多样性； 了解细菌在不同培养基中的不同生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。 二、实验原理 细菌生化试验：在生活细胞中存在的化学反应称之为代谢。代谢过程主要是酶促反应过程。各种微生物在代谢类型上表现出很大的差异，反应出它们具有不同的酶系和不同的生理特性，这些特性可被用作细菌鉴定和分类的内容。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。 二、实验原理－－大分子物质的水解试验 微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。 微生物的胞外酶（如淀粉酶、脂肪酶等）将大分子物质的分解过程可以通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。 例如：淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘测定不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。 二、实验原理－－大分子物质的水解试验 淀粉水解试验 细菌对大分子的淀粉不能直接利用，须靠产生的胞外酶(淀粉酶)将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖(或麦芽糖)，再被细菌吸收利用，细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。 油脂水解试验 脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色转变为深红色，说明细胞外存在脂肪酶。 二、实验原理－－糖发酵试验 糖(醇)类发酵试验 不同的细菌含有发酵不同糖(醇)的酶，因而发酵糖(醇)的能力各不相同。其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来判定。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫[pH5.2(黄色)~6.8(紫色)]，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。 二、实验原理－－甲基红试验 甲基红(Methyl red)试验(该试验简称MR试验) 很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降低到4.2以下，这时若加甲基红指示剂呈现红色。因甲基红指示剂变色范围是pH4.4(红色)～pH6.2(黄色)。若某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱羧，转化成醇等物，则培养基的pH仍在6.2以上，故此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。 吲哚实验 有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，就会形成红色的玫瑰吲哚。 色氨酸水解反应 吲哚与对二甲基氨基苯甲醛反应 大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。 二、实验原理－－吲哚试验 三、实验器材 试验菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌和产气杆菌菌种的斜面各1支。 试剂：卢戈氏碘液、中性红试剂、甲基红试剂、溴甲酚紫等；培养基各成份。 其他实验器材：培养皿、接种环、试管、试管架、酒精灯、记号笔、德汉氏小管、 37℃恒温培养箱等。 四、实验步骤 淀粉水解试验 将配制好的淀粉培养基冷却到50℃左右，以无菌操作制成平板。 用记号笔在平板底部划分成4部分。 将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌分别在不同的部分划线接种，在平板的反面分别做好标记。 将平板倒置在37℃温箱培养24h。 将平皿取出，打开皿盖，滴加少量卢戈氏碘液于平板上，轻轻摇动平皿，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围有无色透明圈出现，说明淀粉已被水解。透明圈的大小，说明该菌水解淀粉能力的大小。 四、实验步骤 油脂水解试验 将配制好的固体油脂培养基冷却到50℃左右，充分摇匀，使油脂均匀分布，以无菌操作制成平板。 用记号笔在平板底部划分成4部分。 将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌分别在不同的部分划线接种，在平板的反面分别做好标记。 将平板倒置在37℃温箱培养24h。 将平皿取出，观察菌苔颜色。如出现红色斑点，说明脂肪水解，为阳性反应。 四、实验步骤 糖(醇)类发酵试验 编号： 在各试管上分别标明发酵培养基名称，所接种的菌名和组号，下同。 接种： 取葡萄糖发酵培养基3支，按编号1支接种大肠杆菌，另1支接种普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。同样取3支乳糖发酵培养基，1支接种大肠杆菌，1支接种普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。 将已接种好的培养基置37℃温箱中培养24h。 观察结果：被检细菌若能发酵培养基中的糖时，则使培养基的pH降低，这时培养基中的指示剂呈酸性反应(为黄色)，若