菌种科学保藏常用方法剖析.ppt

菌种保藏技术 主讲:傅文红 主要内容: 一、菌种保藏的目的 二、菌种保藏的原理（掌握） 三、菌种保藏的方法（重点） 什么是菌种衰退？ 生产菌株性状的劣化或遗传标记的丢失： 1、菌落形态的改变 2、生长速度缓慢 3、生产能力下降 4、抗不良环境能力减弱（抗噬菌体、低温等） 菌种退化原因 1、基因突变 2、连续传代 3、不良培养条件及不良保藏条件 菌种退化的防止 1、减少传代次数 2、用单核细胞和单菌落移种传代 3、菌种纯化 4、采用良好培养基和培养条件 5、科学的保藏 一、菌种保藏的目的 ? 菌种保藏的目的是：使菌种长期保藏之后，仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、形态特征，以及不污染杂菌和不发生虫害。 二、菌种保藏的原理 菌种保藏的原理是通过低温、干燥、隔绝空气（真空）和断绝营养、加保护剂等手段，以达到最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制微生物的生长与繁殖。 由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，所以能够保藏较长时间。 三、菌种保藏的方法 1、斜面低温保藏?（定期移植法） 2、液体石蜡保藏 3、砂土管贮藏 4、 ?麸皮保藏法 5、悬液保藏?： ?1）生理盐水保藏法；2）蒸馏水保藏法：? 6、冷冻真空干燥保藏法 7、液氮超低温保藏法 8、甘油保藏法 国内、国际常用的菌种保藏法 我国常采用的菌种保藏法： 斜面低温保藏?、液体石蜡保藏?、冷冻干燥法、液氮超低温法。?? 国际（ATCC）常采用的方法： 冷冻干燥法（5-15年）、液氮超低温法（20年）。? 斜面低温保藏(定期移植法) 这是一种常用最简便的保藏方法。 为了减少培养基水分散发，延长保藏时间，在配制时琼脂用量加到2.5％，再加入0.2％磷酸氢二钾、磷酸二氢钾及碳酸钙等缓冲剂，以中和保藏过程中产生的有机酸。可以用无菌胶塞代替棉塞，既能防止污染，又可隔绝氧气，避免斜面干燥 细菌：1个月，酵母菌3个月，放线菌、霉菌半年。 二）、液体石蜡法 操作简便，只要在菌苔上灌注一层无菌的液体石蜡，即可使菌种与外界空气隔绝，达到防止培养基水分散失，抑制菌丝新陈代谢，推迟菌种老化，延长菌种生命和保存时间的目的。 此种方法也称为隔绝空气保藏法。  具体方法： 1、石蜡的准备： 选用化学纯液体石蜡100毫升，装入250毫升锥形瓶内，置于0.11兆帕灭菌30～60分钟；然后置于160℃烘箱中处理1～2小时；或置40℃温箱内3天左右，见瓶内液体石蜡呈澄清透明，液层中无白色雾状物时即可。其目的是使灭菌时进入瓶内的水分得到蒸发。 2、接种与保存： 在无菌条件下，将液体石蜡用无菌吸管移入生长健壮、丰满的斜面菌种上，使液体石蜡高出斜面顶端1厘米左右；最后直立放置在洁净的室温下贮藏。 转管时直接用刀切取1小块菌种，移接到新的斜面培养基中央，适温培养，余下的菌种仍在原液体石蜡中贮藏。 三）、砂土管贮藏： 此法应用广泛，适于贮藏孢子和酵母状分生孢子，而对菌丝体不适用。 此法保藏孢子，寿命可达2～10年，使用时在无菌条件下，挑取少许砂土孢子，抖撒在PDA斜面上，适温培养，菌丝生长后，再转管培养1次。 ??? 1.准备砂土: 细河砂，用内径0.250～0.177毫米筛孔过筛,除去粗粒和砂未； 红黄壤土，内径0.149毫米过筛，用磁铁衬纸吸除砂土中铁屑，用0.05～0.1N盐酸浸泡半天，除去有机质。然后用清水反复冲洗至酸碱度近中性后，置于60～80℃烘箱中烘干。 砂土比例2:1或4:1混合，分装入10毫米×100毫米试管或安瓿瓶内，每管装量0.5克，经0.11兆帕121℃高压灭菌30分钟，每天1次，共3次，或160℃干热灭菌1次，保持2～3小时。灭菌后挑取少许砂土移至PDA斜面上培养，证实无杂菌即可。 2、接种: 干接：用接种环直接挑取孢子2～3环，拌入砂土管中 湿接：将孢子刮入5毫升无菌水的试管内，充分摇匀，制在孢子悬液，然后用1毫升吸管吸取悬液，每管中加入0.2毫升。 3、贮藏： 干接法制成的砂土管，直接放在盛有无水氯化钙、变色硅胶或生石灰的广口瓶内保存： 湿接法制成的砂土管，用真空泵抽气8～10小时，使之干燥。放在盛有无水氯化钙或变色硅胶的大试管内，加橡皮塞，放置4～6℃冰箱中贮藏。 四）麸皮保藏法 亦称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入孢子，然后在低温干燥条件下保存。 其制作方法将麸皮与水以一定的