Tan第二章基因工程的工具酶教材.ppt

欢迎同学们听课！ 欢迎研究生听课！ 本课程内容 第一章 绪论 第二章 基因克隆的工具酶 第三章 基因工程的载体 第四章 目的基因的制备 第五章 目的基因导入和重组子的筛选 第六章 外源基因的表达 第七章 基因操作的基本技术 第八章 植物基因工程及应用 第九章 动物基因工程及应用 第十章 医学基因工程及应用 第二章 基因工程的工具酶 2.1 核酸酶 2.2 甲基化酶 2.3 连接酶 2.4 聚合酶 2.5 修饰酶 2.1 核酸酶? 限制性核酸内切酶 2.1.1 限制性核酸内切酶的类型 2.1.2 限制性核酸内切酶的命名法 2.1.3 限制性内切酶的识别序列 2.1.4 限制性内切酶的切割位点 2.1.5 限制性内切酶的切割方式 2.1.6 限制性核酸内切酶的反应体系 2.1.7 限制性核酸内切酶的星活性 2.1.8 限制性核酸内切酶对DNA的消化作用 2.1.9 限制性核酸内切酶酶切注意事项 几乎所有的生物都能合成自身所需要的酶，包括许多病毒。 酶参与所有生命活动过程，其在细胞内的分布、含量、活性等随生物生长、发育及外界条件的改变而改变。 Ribozyme：具有催化能力的RNA。酶不都是蛋白质。 定义：由活细胞产生，能在体外和体内起同样催化的一类具有特殊空间结构的生物大分子，包括蛋白质和核酸等。 限制性内切酶（Endonucleosase）的发现 50年代初发现细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断，从而保证其不为外来噬菌体所感染，而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护，这种现象叫做限制－修饰，它们由三个基因位点所控制：hsd R, hsd M, hsd S, 十年后，人们搞清了细菌的限制与修饰分子机理： 　　hsd R限制性内切酶 　　hsd M限制性甲基化酶 　　hsd S控制两个系统的表达 1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类内切酶，Hind II和Hind III，为基因工程技术的诞生奠定了基础。 截止到目前为止，已经分离出400余种II类酶，搞清识别位点的有300种，商品化的约有100种，而实验室常用的有20种 。 限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease)概念： 是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。 是生物细胞内限制性修饰系统的一部分，防 止外源DNA的入侵。 2.1.1 限制性核酸内切酶的类型 三类：I型、II型、III型。 I类：最早发现，能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近切割双链，但切割序列没有专一性。3个亚基： Hsd S－识别特定DNA序列 Hsd M－甲基化 Hsd R－限制性内切酶功能 三个亚基组成复合体，全酶才有活性。 biochemistry：need ATP, Mg++ , long sequences (1000-5000 nt) , at random unspecial, can’t be used in genetic engineering III类：识别位点严格专一（不是回文序列），但切点不专一，往往不在识别位点内部。 2个亚基组成： Hsd M－甲基化 Hsd R－限制性内切酶功能 需要ATP、Mg2+，类似于 I 应用同样受限制。 II类：识别位点（回文序列）严格专一，并在识别位点内将双链切断。因此在基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切酶。 应用最广，酶最简单(Mg2+)，不需要特殊条件 具有两个亚基： Hsd M－甲基化 Hsd R－限制性内切酶功能 切割特异 2.1.2 限制性核酸内切酶的命名法 用属名第一个字母和种名的头两个字母组成的3个字母斜体的略语表示寄主菌的物种名以及菌株（型）的代号命名。该菌株（种）中发现的不同的酶按照顺序以罗马字母编号I, II, III等。如：Escherichia coli 用Eco表示。第四个字母代表菌株或株型、变种名，若酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子。例：Hind III 从流感嗜血菌株（Haemophilus Influenzue）d 株中分离的第三个酶。EcoR I 表示基因位于Escherichia coli中的抗药性R质粒上。 derivation： first three names from the latin names of the microorganism that produces them. first letter(genus), next two letters(species) writing：前三个字母用斜体，其他用正体表示。 如果酶存在于一种特殊菌株中，三个字母后加上菌株名称符号,名