Tan第四章目的基因的制备教材.pptVIP

欢迎同学们听课！ 欢迎研究生听课！ 本课程内容 第一章 绪论 第二章 基因克隆的工具酶 第三章 基因工程的载体 第四章 目的基因的制备 第五章 目的基因导入和重组子的筛选 第六章 外源基因的表达 第七章 基因操作的基本技术 第八章 植物基因工程及应用 第九章 动物基因工程及应用 第十章 医学基因工程及应用 第四章 目的基因的制备 目的基因（target gene） 是指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或DNA片段。 是编码某一产物与某些性状相关的基因 本章分两节 4.1 目的基因的制备方法 4.2 克隆基因的分离 4.1 目的基因的制备方法 4.1.1 直接分离法 4.1.2 构建基因文库分离法 4.1.3 PCR法 4.1.4 化学合成法 克隆基因的方法有很多，根据研究基础的不同，可以使用以下的方法克隆目的基因： 1. PCR或RT-PCR法2. 从基因文库中分离基因3. 从cDNA文库中分离基因4. 转座子标签法5. 图位克隆法6. 差减杂交法、扣除杂交、差异显示法7. 人工合成法本章中主要介绍从基因文库中筛选目的基因的几种方法。获得目的克隆的方法有两种1） 目的基因的直接选择2） 从基因文库中筛选 4.1.1 直接分离法 直接选择的基因比较少，如抗生素抗性基因。如克隆一个kan抗性基因，在R6-5质粒上含有四种抗性基因：kan, 氯霉素、链霉素、硫胺类药物，kan抗性基因存在于13个EcoRI片段中的一段中。将R6-5的片段插入pBR322的EcoR I位点中，连接混合物中将含有13个不同片段的大量重组拷贝，其中部分是kan抗性的。只有含kan的克隆才能在含有kan的培养基上正常生长。1） 标记援救可以扩大直接选择的范围　　利用E. coli的突变系可扩展该项技术。例如要从E. coli中克隆trpA基因，编码色氨酸合成酶，一个突变系不能合成色氨酸，只有加入色氨酸后才能存活。 因此E. coli的突变体可以用来克隆trpA基因。首先从一个正常个体中提取总DNA，然后酶切，连接产生大量重组DNA分子，其中一个将携带完整的trpA基因。连接混合物用来转化缺陷型E. coli细胞，大部分转化子是缺陷型的，携带trpA的重组子将是野生型的，可以在基本培养基上生长。 直接选择法克隆Kan抗性基因 2）标记援救的范围和限制　　存在两个限制因素：　　1） 必须存在着目的基因的突变品系　　2） 需要一种只有野生型能够生长的培养基。　　一般而言，标记援救适用于微生物的合成酶可以在基本培养上选择。 标记拯救法克隆trpA基因 4.1.2 构建基因文库分离法 4.1.2.1 基因组文库的构建 4.1.2.2 cDNA文库的构建 4.1.2.3 基因文库的筛选 基因文库（gene library） 基因文库：是某种特定的生物所含有的能够包含所有基因的足够数目的克隆的集合（将生物材料的基因组DNA或cDNA片段化，然后与特定的载体连接导入宿主菌形成包含目的基因在内的DNA片段的克隆群）。基因文库是通过纯化细胞总DNA，然后利用特定的限制性酶酶切产生能插入载体的片段，一般是λ替换载体、粘粒或者是YAC。 对于植物、动物，所需要的克隆数很大，鉴定目的基因是一项艰巨的任务。对于这些生物体，可以使用细胞特异的cDNA文库。cDNA文库是将mRNA反转录成cDNA，插入载体中构建的文库。每一个细胞都含有相同的基因，但不同细胞中有的基因是表达的， 而有的基因关闭。只有少量基因在所有的细胞类型中都表达，利用mRNA构建的基因文库，只含有表达的部分基因。例如麸朊（醇溶朊），小麦中的一种营养蛋白，在正发育的种子中，以非常高的水平表达，大约占总mRNA的30%。 4.1.2.1 基因组文库的构建 基因组文库（genomic library） 某种生物的基因组的全部遗传信息（DNA序列）通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体中，这个群体即为这种生物的基因组文库。 基因组文库中的各克隆的插入片段叠加起来应包含了基因组的全部序列。 基因组文库的克隆数目＝基因组DNA总长/DNA插入片段的平均长度 Clark 和Carbon 提出估算基因组文库大小的经验公式： N＝ln(1-P)/ln(1-f) N：基因文库必需的克隆数目； P：文库中含目的基因DNA片段出现的概率； f：插入片段的大小与基因组大小的比值。 基因组文库的构建过程 ?噬菌体基因组文库的构建 Cosmid基因组文库的构建 YAC基因组文库的构建 4.1.2.2 cDNA文库的构建步骤 cDNA文库和cDNA文库的大小 cDNA文库（cDNA l