22蛋白质的电泳分离3解说.ppt

第六节 蛋白质的电泳分离 一、电泳的基本原理 二、电泳的类型 三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 四、凝胶免疫电泳 五、高效毛细管电泳 六、印渍转移法（Western blotting） * * 蛋白质是两性电解质，在一定的pH下，可以解离成为带正电荷或带负电荷的粒子。在电场中，带正电荷的粒子向负极移动；带负电荷的粒子向正极移动。带电粒子在电场中所受的力： 一、电泳的基本原理 E为两个电极间的电势差; d是两个电极间的距离; E/d就是通常所指的场强; Q 为粒子所带电荷。 F = Q · E d 电泳技术是鉴定生物大分子和分析其纯度的重要方法。 根据Stoke方程，这种阻力的大小取决于粒子的大小和形状以及粒子所通过的介质的粘度： F’=6πrηυ 如果是在真空里，带电粒子的移动会很快，最后撞到电极上。但是，在溶液里就不会是这样，因为电场对粒子的拉力被运动的分子和溶液之间产生的阻力或摩擦力所平衡。 F’是球形粒子的阻力；r是球形分子的半径；η是溶液的粘度；υ是粒子运动的速度。 在溶液中，电场所产生的加速力被阻力平衡，即F= F’，因此有： Q·E/d=6πr η v 由上式可以看出，粒子在电场里运动的速度与场强和粒子的电荷成正比，但与粒子的大小和溶液的粘度成反比。 粒子在电场中移动的速度常用电泳迁移率来表示，即带电颗粒在单位电场度下的泳动速度： 式中，M为迁移率；L为粒子泳动的距离；t为通电（电泳）时间。在一定条件下，对于一定的粒子，M是一定的。因此，它是描述物质在电泳中行为的特征参数。 影响迁移率的因素概括起来有如下几种： ① 蛋白质粒子的性质 电荷越多，泳动速度越快。粒子大小和形状也影响泳动速度。较大粒子与周围介质摩擦力增加，泳动率下降。球蛋白粒子的摩擦力和静电作用力小于纤维蛋白粒子。 ② 电场 迁移率与电流和电压成正比，与电阻成反比。 影响迁移率的因素： ③ 缓冲液和离子强度。 缓冲液的种类直接影响电泳结果。用Tris-HCl分离蛋白质时，HCl解离成Cl-,其泳动速度比蛋白质快得多。由于样品与缓冲离子的泳动速度不一致，引起不对称峰出现。若改用Tris-HAc和Tris-硼酸，可消除此现象。缓冲液的pH直接影响样品的解离程度和电荷密度。 ④支持介质 介质结构对分子泳动速度有很大影响。介质对样品颗粒的吸附可导致样品的拖尾，降低分辨率。纸的吸附作用最大，醋酸纤维素吸附较小。有的支持介质（如纸和淀粉胶）具有较强的电渗作用，即电泳缓冲液相对于固体支持物的相对移动。显然，电渗作用影响了泳动率。 电渗现象 液体在电场中对于一个固体支持物的相对移动，称为电渗现象。 例如，在纸电泳时，由于纸上带有负电荷，而与纸接触的水溶液因为静电感应带有正电荷，在电场的作用下溶液便向负极移动并带动着质点向负极移动。 假如这时进行电泳，则质点移动的表面速度是质点移动速度和由于溶液移动而产生的电渗速度的加和。 二、电泳的类型 1. 电泳基本上分为两大类： 1) 自由界面电泳 包括微量电泳、显微电泳、等点聚焦，蔗糖密度梯度电泳及等速电泳等 。 2) 使用支持物的区带电泳 按支持物的类型又分为：纸上电泳、醋酸纤维薄膜电泳、薄层电泳、非凝胶电泳和凝胶电泳。 2. 按使用形式分类: 水平式、垂直式、板形、柱形电泳、双向电泳、连续流动电泳及电泳和层析（如分子筛）相结合的技术。 3.按使用目的分类: 分析型和制备型两种。 4.按操作原理电泳可分类： 一般电泳、等速电泳、等电聚焦电泳和免疫电泳等。 自由界面电泳过程中扩散严重、分辨率有限，而且设备昂贵、操作繁琐，现已基本被区带电泳所取代。 区带电泳分辨率很高，而且设备简单、操作方便、经济实用。 三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 目前对蛋白质分离有着高分辨率的电泳支持物首推聚丙烯酰胺凝胶（PAG），它电渗作用小、孔度可以控制、物理化学性质稳定。 PAG电泳是根据物质所带电荷及其分子大小、形状的差异，在电场作用下产生不同电泳速度而分离的技术，它有静电效应和分子筛效应，分辨率很高。 在PAG中加两性电解质载体便成为等电聚焦电泳，加入SDS，即成为SDS-PAG电泳。 (一) 盘状电泳 PAGE有连续式和不连续式。 1. 一些基本概念： 凝胶与电泳缓冲液的pH和离子浓度相同，称为连续式电泳。 这种凝胶是微孔物质、样品不易扩散，加上兼有分子筛作用，分离效果较好。 在这种连续电泳方式的基础上，又开发了不连续凝胶电泳，电泳带像一个薄盘嵌在凝胶柱中间，故称盘状电泳。 由于使用的胶浓度、pH、电压都是不连续的，所以又称不连续电泳，简称Disc