基因工程(研究生课程班)重点.ppt

相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 基本原理 重组DNA技术与医学的关系 （二）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 （三）目的基因 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 三、重组技术与医学的关系 不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。 目 录 2. 平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 目 录 3. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。 5′ 3′ 3′ 5′ 载体DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ T(T)nT T(T)nT 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ A(A)nA A(A)nA 3′ 5′ λ-核酸外切酶 λ-核酸外切酶 末端转移酶 + dATP 末端转移酶 + dTTP T(T)nT A(A)nA A(A)nA T(T)nT T4 DNA连接酶 15oC 重组体 目 录 4. 人工接头(linker)连接 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 人工接头及其应用 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5′- 3′- Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ 目 录 DNA连接酶 ------ 磷酸二酯键的形成 DNA连接酶 目的基因与载体的连接 接 + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体用Bam HⅠ切割 切 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 接 重组体转入受体细胞 转 受体细胞 转化（transformation） 转染（transfection） 感染（infection） CaCl2处理 受体细胞 50-100mmol/L CaCl2 感受态细胞 重组体转入细胞 转 化 transformation 基因重组 体外包装 噬菌体 噬菌体体外包装 转 染 transfection （五）重组体克隆的筛选与鉴定 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法得到含有重组DNA的阳性克隆。 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救 (3) 分子杂交法:原位杂交、Southern印迹 (1) 酶联免疫检测 (2) 放射免疫法 (3) 免疫印迹法（Western blot） 1. 直接选择法 2. 间接选择法 (插入失活法) 抗药性标记选择 目 录 α 互补的检测 目 录 原位杂交 目 录 Southern印迹 目 录 鸡的β肌球蛋白的克隆和检出 目 录 重组DNA技术操作过程可形象归纳为 小 结 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体菌 筛 筛选重组体 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 目 录 1.目的基因的获取 1) 化学合成法 2) 基因组DNA文库 3) cDNA文库 4) 聚合酶链反应(PCR) 1）化学合成法 主要用于合成编码小分子活性多肽的基因 基因的DNA序列已知 DNA合成仪 化学合成法获取目的基因 由已知