10第十一章DNA序列测定和分析.ppt

第十一章 DNA序列测定和分析 一、加减法测序 加减法测序 加减法测序 二、双脱氧链终止法 双脱氧链终止法测序原理 Sanger双脱氧链终止法测序 双脱氧链终止法测序注意事项 M13作载体的Sanger测序过程 双向测序示意图一 双向测序示意图二 双脱氧链激光荧光法 自动化测序的输出信号 三、Maxam-Gilbert 化学直读法 Maxam-Gilbert 化学直读法 Maxam-Gilbert 法测序 Maxam-Gilbert 化学直读法的反应 Maxam-Gilbert 法测序原理 A C 的反应 四、测序策略 鸟枪法 引物步移法 引物步移法 五、第二代测序技术 1. Roche（454）GS FLX sequencer （1）构建测序文库 （2）乳滴PCR （2）乳滴PCR （3）PicoTiterPlate载样 （4）测序 焦磷酸测序反应 焦磷酸测序反应 GS FLX系统的特点 2. Solexa Sequencer （1）样品制备、附着、桥型扩增 桥型扩增成簇 （2）合成测序 测序反应 （3）结果分析 测序时加的第一类核苷酸 测序时加的第二类核苷酸 Solexa技术的特点 3. SOLiD sequencer 边连接边测序法 （1）制备DNA片段文库 制备mate pair文库 制备mate pair文库 （2）乳滴PCR 磁珠固定 （3）边连接边测序 第一轮连接反应 检测荧光、切去荧光基团 第二轮连接反应 检测荧光、切去荧光基团 换后移一位的引物再次连接 用两套引物测定mate pair文库 荧光颜色与序列的关系 SOLiD sequencer 的特点 4. HeliScope Sequencer HeliScope测序的基本流程 HeliScope测序的基本流程 测序步骤 测序步骤 测序步骤 记录各位点的发光情况 两遍测序 HeliScope测序的特点 单分子测序的进展 Ion Torrent 半导体测序 六、杂交测序与DNA芯片技术 杂交测序的过程 DNA芯片杂交测序 杂交测序的原理 杂交测序存在的问题 DNA芯片的制作类型 DNA芯片的光导就位合成 DNA芯片的光导就位合成 DNA芯片的用途 CDA芯片的制作和杂交 七、DNA序列分析 除去第一个核苷酸的荧光基团 加第二个核苷酸，荧光定位 平板 平板 目前，HeliScope测序法的平均读长在25bp左右，最长可达到30bp。在第一轮测序结束后，通过加热解链，可以对同一DNA模板分子进行第二遍测序（two-pass），其错误率可以控制在0.2%～1%之间，每小时可获得大约25～90Mb的数据。HeliScope的最大的优势在于它不需要经过PCR扩增模板。它的荧光捕获系统检测灵敏度非常高，能检测一个单分子合成所释放的荧光信号。由于不需经过预扩增，它可以避免很多因为PCR扩增而引入的不确定因素，而且可以通过二轮测序来提高测序的准确性。同时HeliScope测序所消耗的试剂量也会大大降低，因此它的测序成本是目前所有新一代测序仪中最低的。 Helicos BioSciences announced improvements in the performance of the Helicos Genetic Analysis System. With these improvements, the system is generating 20 to 30 Gigabases (Gb) of high-quality sequence data per run, an output equivalent to the sequencing of 7 to 10 human genomes per run. This new performance point generates high-quality data at a rate of 100 to 150 Megabases (MB) per hour. These data are available on the HeliSphere Technology Center, the companys open access Web site showcasing single molecule sequence data and open source informatics tools. Ion Torrent 技术通过专有的大规模并行半导体感应器，对DNA复制时产生的离子流，实现直接和实时的检测。当试剂通过集成的流体通路进入Ion Torrent 半导体芯片中，密布于芯片上的反应孔立即成为上百万个微反应体系。这种独特的流体体系、微体系机械设计和半导体的技术组合，得以快速直