考马氏法测定蛋白质含量总结.pptVIP

目的 1、掌握考马斯亮蓝法测蛋白质含量的基本原理及优缺点。 2、掌握标准曲线的制作方法。 考马斯亮蓝法 Bradford 1976年由Bradford建立的考马斯亮蓝法,是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法之一. Bradford 法和 Lowry 法灵敏度高，比紫外吸收法高10-20倍 原 理 1、考马斯亮蓝G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料最大吸收峰位置,由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕红色变为蓝色.染料主要是与蛋白质中碱性氨基酸和芳香氨基酸残基结合. 2、在595nm下测定的吸光度A595,与蛋白质 浓度成正比. Bradford 法的突出特点: (1)灵敏度高. 其最低检测蛋白质含量可达1ug/ml,这是因为蛋白质与染料相结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的吸光系数 ?,因而光吸收要比Folin –酚试剂法大得多 (2)测定快速,简洁, 只需要加一种试剂.完成一个样品的测定,只要5分钟左右 .由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好. (3).干扰物质少 一些阳离子如K+、Mg+、Na+和硫酸铵等不干扰测定。 干扰物质：去污剂 SDS、TritonX-100 此法缺点: (1).由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此 Bradford 法用于不同蛋白质时有较大的偏差 . (2).仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有去污剂等 (3).标准曲线也有轻微的非线形,因而不能用比尔定律进行计算而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度. (二) 试剂与器材 1.试剂: (1)标准蛋白质溶液,用牛血清蛋白配制成1.0mg/ml (2)考马斯亮兰G-250染料试剂:称100mg考马斯亮兰G-250,溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml85 %的磷酸,用水稀释至1L 2.器材 (1)可见光分光光度计 (2)试管8支 (三)操作方法 （2）取9支试管，编号为0～7号和样品管。0号管加入1.0ml水，1～6号和样品管依次加入对应的蛋白稀释液与水。然后各加入5.0ml蛋白质染色液。充分振荡混匀后，两分钟于595nm处比色。以蛋白质浓度为X轴，吸光度A为Y轴做图，绘制标准曲线，求出样品蛋白质含量。 比色皿的使用 1.由于紫外光不能透过玻璃比色皿，紫外光区测量时要用石英比色皿。 2.同组使用的比色皿必须配套（规格、新旧程度一致）。 3.比色皿2光面与2毛面，光学表面对准光路，不能有任何污损，否则会引起光吸收的增加。 4.比色皿中所盛溶液不能太少，也不能太多，一般所盛液体约占全部容积的2/3。 5.腐蚀性溶液不得长期盛放在比色皿中。 6.每次使用后,应立即倒空，然后用水冲洗比色皿。本次试验，考马斯亮蓝可使玻璃比色皿着色，用20%酒精清洗。 问题 1、在实验中，使用的水一定是蒸馏水吗？为什么？ 2、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量使用的局限性有哪些？ 3、分光光度法测定时，设置空白管的作用？ * * 改进后的操作步骤 管 号 0 1 2 3 4 5 6 7 8 标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 (100μg/ml) 未知蛋白质 0.2 0.6 蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.4 考马斯亮蓝 G－250试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋 白质量（?g） 光吸收值 （A595） *